探讨自然杀伤(NK)p44＋NK细胞在类风湿关节炎(RA)滑膜增生及炎症中的作用及机制。
采用流式细胞术检测50例RA患者及50名健康对照者外周血、30例RA患者滑液中NKp44＋NK细胞比例。流式细胞术分选5例RA患者滑液NKp44＋NK细胞(108/L), ELISA检测NKp44＋NK细胞培养上清白细胞介素(IL)-22浓度。NKp44＋NK细胞培养上清作用于RA成纤维样滑膜细胞(FLS)24、48及72 h，MTT法检测FLS增殖。rhIL-22作用RA FLS 72 h后检测单核细胞趋化蛋白(MCP)-1分泌。
(1)RA患者外周血NKp44＋NK细胞比例为1.270%，高于健康对照外周血NKp44＋NK细胞比例0(P<0.01)；RA患者滑液NKp44＋NK细胞比例为15.190%，高于自身外周血NKp44＋NK细胞比例2.425%(P<0.01)。(2)RA滑液NKp44＋NK细胞体外培养2周，其上清IL-22浓度(1 603±332) ng/L。(3)NKp44＋NK细胞上清作用于RA FLS 24、48、72 h均能刺激RA FLS增殖(P<0.01)。IL-22抗体能明显抑制NKp44＋NK细胞上清诱导的RA FLS增殖(P<0.01)。(4)1及10 μg/L rhIL-22作用于RA FLS 72 h可促进FLS MCP-1分泌(P<0.01)。
NKp44＋NK细胞能分泌IL-22促进RA FLS增殖及MCP-1分泌，可能在RA滑膜增生及炎症中具有重要作用。
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自然杀伤 (NK)细胞在类风湿关节炎(RA)发病中有重要作用[1,2,3]。RA时存在NK细胞的激活，出现多种不同表型的NK细胞，如NKp44＋NK细胞等[2,3,4]，其功能特征发生改变，可能参与了RA的发生发展。NKp44＋NK细胞可能与疾病活动度和病情严重程度相关[5]。本研究目的是了解此类NK细胞亚群的水平及其在RA病理过程作用及机制。
选取2011年9月至2013年3月在暨南大学附属第一医院风湿科门诊及住院的RA患者50例，男10例，女40例，平均年龄47岁。所有RA病例均符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA分类标准，并除外其他自身免疫性疾病、感染、肿瘤等关节相关疾病。健康对照组为健康体检者，共50名，其中男8名，女42名，平均年龄46.8岁。所有受试者均签署知情同意书。两组对象年龄、性别差异无统计学意义。
流式细胞仪(BD FACSAria™1)，低温高速离心机，水浴锅，WH2861涡旋混合器(麒麟医仪)，恒温细胞培养箱，抗CD56-FITC抗体、抗CD3-PE CY5抗体、抗NKp44-APC抗体、鼠IgG1-FITC抗体、鼠IgG1- PE CY5抗体、鼠IgG1-APC抗体(美国BD公司)，PMA、ionomycin、MTT溶液、DMSO溶液(美国Sigma公司)，IL-22 ELISA试剂盒(Excell Biology)，酶标仪(美国BioTck公司)，免疫组化试剂盒(博士德)。
采用流式细胞仪，将RA患者及健康对照外周血90 μl与3种荧光抗体——抗CD56-FITC抗体、抗CD3-PE Cy5抗体、抗NKp44-APC抗体各10 μl避光孵育30 min。加入2 ml溶血液，避光孵育10 min，1100 r/min离心5 min，弃上清。PBS清洗细胞，加入300 μl PBS上机检测。关节滑液操作步骤基本同上，只是不需要溶血。每管同时做同型对照。
采用流式细胞术。将RA患者滑液4 ml, 1100 r/min离心5 min，弃上清。PBS清洗细胞后，加入3种荧光抗体——抗CD56-FITC抗体、抗CD3-PE Cy5抗体、抗NKp44-APC抗体各150 μl，避光孵育30 min。PBS清洗细胞后，加入300 μl PBS上机分选，共分选105/ml细胞。10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液悬浮培养细胞，每2～3天换液1次，培养2周后进行实验，流式检测细胞纯度>90%。
采用组织块原代培养方法进行RA FLS培养，采用生长状态良好的第3～5代细胞进行实验。用免疫组化法对RA FLS波形蛋白(vimentin)进行鉴定，按照试剂盒说明书进行SABC-DAB法染色。
NKp44＋NK细胞加入终浓度为20 μg/L的佛波酯溶液和0.5 μmol/L的离子霉素(ionomycin)溶液刺激4 h后进行实验。
采用MTT法。将1×105/ml FLS悬液100 μl接种于96孔培养板中。空白对照组加入10%FBS的RPMI 1640培养液100 μl，实验组加入NKp44＋NK细胞培养上清液100 μl，3块培养板培养24、48、72 h后，MTT法检测RA FLS增殖。
RA FLS(105/ml)接种于96孔培养板中，空白对照组加入10%FBS的RPMI 1640培养液100 μl，实验组加入：(1) NKp44＋NK细胞培养上清液100 μl；(2)含50 mg/L IL-22抗体的NKp44＋NK细胞培养上清液100 μl。培养24 h后MTT法检测RA FLS增殖。
将RA FLS接种于6孔培养板中(105/ml)，空白对照组加入10%FBS的RPMI 1640培养液500 μl，实验组加入：(1)含1 μg/L rhIL-22的10%FBS的RPMI 1640培养液500 μl；(2)含10 μg/L rhIL-22的10%FBS的RPMI 1640培养液500 μl。培养72 h后ELISA检测MCP-1分泌。
采用SPSS 15.0统计软件，计量资料用
±s或M±INQ表示，正态分布计量资料总体比较采用两独立样本t检验或单因素方差分析，两两比较采用Bonfferroni检验。非正态分布计量资料采用多重非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
RA患者外周血NKp44＋NK细胞比例为1.27%，健康对照组外周血NKp44＋NK细胞比例为0，两者比较P<0.01；RA患者滑液NKp44＋NK细胞比例为15.190%，自身外周血NKp44＋NK细胞比例为2.425%，两者比较P<0.01。
原代培养第7天即可见到组织块周围有细胞游出。滑膜细胞在体外培养条件下通过3次传代后主要以梭形的FLS为主。光镜下FLS呈长梭形，细胞核呈卵圆形位于细胞中央，胞质透亮，排列有局部方向性(图1)。采用中胚层组织细胞特征性蛋白Vimentin单克隆抗体进行免疫组化标记，FLS胞质出现棕黄色颗粒(图2)。
流式分选5例RA患者滑液108/L NKp44＋NK细胞体外培养2周，细胞纯度>90%。20 μg/L的佛波酯溶液和0.5 μmol/L的离子霉素溶液刺激后NKp44＋NK细胞培养上清IL-22浓度为(1 603±332) ng/L。
NKp44＋NK细胞上清(IL-22浓度为1 460 ng/L)作用RA FLS 24、48、72 h后RA FLS增殖明显，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，表1。
NKp44+NK细胞上清对RA FLS增殖影响(A450值，
±s)
NKp44+NK细胞上清对RA FLS增殖影响(A450值，±s)
| 组别 | 24 h | 48 h | 72 h |
|---|---|---|---|
| 空白对照组 | 0.120±0.003 | 0.132±0.004 | 0.137±0.003 |
| NKp44+NK上清 | 0.175±0.002 | 0.186±0.002 | 0.194±0.001 |
注：两组24、48及72 h比较均 P<0.01
空白对照组、NKp44＋NK细胞上清组、IL-22抗体组A值分别为0.120±0.003、0.175±0.002及0.151±0.001，3组间总差异有统计学意义，P<0.01，IL-22抗体组FLS增殖较NKp44＋NK细胞上清组下降P<0.01。
rhIL-22组1及10 μg/L的MCP-1 A值分别为0.478±0.001、0.653±0.001，与空白对照组(0.350±0.002)比较差异有统计学意义(P<0.01)；rhIL-22组1 μg/L与10 μg/L比较P<0.01。
NK细胞具有强大的细胞因子分泌功能，其活化后能分泌多种细胞因子，引起自身和T、B淋巴细胞的增殖活化和细胞因子产生，从而激发更有效的适应性免疫应答[1,6]。NK细胞在RA发病过程中起着重要作用。NK细胞也可通过和其他细胞间的直接接触来参与RA发病。从RA患者关节滑液中分离的NK细胞能够诱导CD14＋的单核细胞分化为破骨细胞[7]。NK细胞功能与其表面受体的表达密切相关。在NK细胞多种受体中，NKp44受体属于自然细胞毒性受体，只表达于活化NK细胞表面，是NK细胞活化的主要标志受体。Pridgeon等[2]和de Matos等[3]都发现，RA患者滑液中NKp44＋NK细胞明显升高。Cella等[4]发现，NKp44＋NK细胞能分泌包括IL-22在内的多种细胞因子，促进自身及其他免疫细胞聚集，在炎症过程中发挥重要作用。
本研究发现，RA患者滑液NKp44＋NK细胞比例明显高于患者外周血，说明NKp44＋NK细胞在关节炎症部位聚集。NKp44＋NK细胞培养上清可明显促进RA FLS增殖。RA FLS增殖与局部关节炎症和血管翳形成、骨破坏密切相关[8]，这提示，滑液NKp44＋NK细胞是参与RA发生发展的。进一步对NKp44＋NK细胞功能研究发现，NKp44＋NK细胞体外能分泌高浓度的IL-22。IL-22可诱导RA FLS增殖和炎性细胞因子分泌，IL-22可以促进破骨细胞生成。阻断NKp44＋NK细胞上清中IL-22作用后，发现NKp44＋NK细胞促RA FLS增殖的作用明显减弱，提示IL-22是NKp44＋NK细胞分泌的促RA FLS增殖的一种重要细胞因子。本研究还发现，1 μg/L的rhIL-22能促进RA FLS分泌MCP-1。MCP-1为RA FLS分泌的一种炎症性趋化因子，其受体CCR2是一类表达于不同类型细胞上的含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体。MCP-1与CCR2结合后使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集，促进局部炎症反应。说明RA患者NKp44＋NK细胞通过分泌IL-22促进RA FLS增殖及MCP-1分泌，在RA滑膜增生及炎症中具有重要作用。
