探讨多靶点粪便DNA与粪便潜血（FIT-DNA）联合检测技术对结直肠癌及进展期腺瘤的临床诊断价值。
纳入中国医学科学院肿瘤医院2021年4月至2022年1月拟行肠镜检查的门诊筛查患者及结直肠外科待手术的肠癌患者235例，其中男141例，女94例，年龄22~86（55±13）岁。包括初诊未治疗组215例（结直肠癌患者86例、进展期腺瘤患者12例、非进展期腺瘤患者25例、一般性息肉患者8例、表观健康人84名）和干扰组20例（既往行结直肠癌根治术患者2例、既往行内镜黏膜剥离术患者6例、非肠癌的特殊疾病患者4例以及行新辅助放化疗的肠癌患者8例）。取肠道准备前的新鲜粪便样本进行FIT-DNA联合检测，样本处理和核酸纯化采用FIT-DNA 检测试剂盒；采用荧光探针法检测KRAS突变和BMP3、NDRG4基因甲基化；采用免疫法检测便潜血。以结直肠镜或病理活检结果为金标准，采用受试者工作特征（ROC）曲线评估FIT-DNA联合检测技术对结直肠癌及进展期腺瘤的筛查及诊断效能。
FIT-DNA联合检测技术对早期结直肠癌和进展期腺瘤的筛查灵敏度分别为7/7和8/12，阴性预测值分别为98.1%（104/106）和93.7%（104/111）；对早期结直肠癌和进展期腺瘤的总体筛查灵敏度为15/19，阴性预测值为96.3%（104/108）；曲线下面积（AUC）分别为0.982（95%CI：0.960~1.000，P<0.05）、0.758（95%CI：0.592~0.924，P<0.05）和0.841（95%CI：0.724~0.957，P<0.05）。FIT-DNA联合检测技术对结直肠癌的诊断灵敏度为98.8%（85/86），对进展期腺瘤的诊断灵敏度为8/12，对结直肠癌和进展期腺瘤的总体诊断灵敏度为94.9%（93/98），特异度为88.9%（104/117）；AUC分别为0.968（95%CI：0.937~0.997，P<0.05）、0.758（95%CI：0.592~0.924，P<0.05）和0.942（95%CI：0.905~0.979，P<0.05）。纳入干扰组后，FIT-DNA 联合检测技术的总体诊断灵敏度为91.6%（98/107），特异度为89.1%（114/128）。
FIT-DNA 联合检测技术对结直肠癌具有较高的早期筛查效能和诊断效能。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常发生的恶性肿瘤之一，在所有新发恶性肿瘤中占10 %，居全球第三，而死亡率仅次于肺癌，占9.4%［1］。随着我国社会经济发展、居民生活方式转变以及人口老龄化的加剧，我国CRC发病率和死亡率呈现明显上升趋势。2019年国家癌症中心发布的中国肿瘤登记年报显示，2015年我国CRC每年新发病例达38.8万例，年新增死亡病例达18.7万例［2］。CRC普遍由大肠息肉和（或）腺瘤等癌前病变演变而来［3, 4］，其发展过程相对缓慢（10~15年），为癌前病变的早诊早治和阻止癌变提供了较长的窗口期。相关研究提示，越早期发现CRC或癌前病变，患者的生存率越高［5］。然而，CRC早期症状并不特异，80%以上CRC患者发现时已是中晚期，近50%的CRC患者会出现复发转移，5年生存率不到20%［6］。因此，在结直肠肿瘤的预防管理方面，早期筛查、早期发现和及时干预治疗将有助于发现CRC及早期病变，从而降低死亡率。
CRC发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段的病变进程［7］。携带肿瘤突变信号的异常细胞会脱落到粪便中，粪便中含有足量DNA可供捕获到肿瘤信号，通过检测粪便里的脱落细胞可以有效捕获肿瘤的突变基因，为早期大肠癌的分子检测提供了理论基础［8］。CRC的早期DNA标志物众多。原癌基因KRAS突变是CRC发生的重要早期事件，基因突变发生率高达45%［9］。而抑癌基因启动子高甲基化也是肿瘤发生的另一重要机制，已有研究证实肿瘤抑制因子BMP3、NDRG4高度甲基化是CRC早期的重要生物学特征［10］。因此，联合检测多个相关基因要比单个突变更加敏感［11, 12］。
结直肠镜检查及病理活组织检查虽然是诊断CRC的金标准，但由于其具有侵入性，加之繁琐的肠道准备、患者恐惧心理及医疗资源不足等因素，其无法成为常规的筛查方法［13］。近年来，多靶点粪便DNA与粪便潜血（multi-target stool fecal immunochemical test-DNA，FIT-DNA）联合检测技术应运而生，相较于侵入性的结肠镜检查，其具有无创简便的优点［14］。尽管之前有部分研究报道了FIT-DNA联合检测技术对于CRC患者的筛查效能评估，但尚未见明确区分该技术对早期诊断和早期筛查的临床价值评估，尤其是对于伺机性筛查高危人群的分类［15, 16, 17］。本研究采用盲法，前瞻性地纳入伺机筛查患者进行 FIT-DNA联合检测技术的临床预测效能评估，旨在探索CRC早期筛查与辅助诊断的实施模式。
1.对象：本研究通过中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准（伦理审批号：22/139-3340），所有受试者均签署知情同意书。前瞻性地纳入中国医学科学院肿瘤医院2021年4月至2022年1月拟行肠镜检查的门诊筛查患者及结直肠外科待手术的CRC患者315例，进行伺机性筛查。其中235例为有效受试者，均接受了肠镜确诊和（或）病理确诊，包括男141例，女94例，年龄22~86（55±13）岁；另有80例因未接受FIT-DNA联合检测或肠镜/病理确诊，被剔除本研究。在本研究中，早期CRC（简称早癌）定义为局限于结直肠黏膜层及黏膜下层、未累及固有肌层的癌［18］，包括1例0期和6例Ⅰ期患者。结直肠进展期新生物定义为CRC和进展期腺瘤。进展期腺瘤诊断依据为：（1）直径≥1 cm；（2）高级别上皮内瘤变；（3）具有25%以上绒毛成分；满足以上任意1条即可。
2.初诊且未治疗组：215例，包括CRC患者86例、进展期腺瘤患者12例、非进展期腺瘤患者25例、一般性息肉患者8例、表观健康人84名。（1）纳入标准：年龄>18岁，性别不限；受检指征为体检或具有非特异性症状，例如：腹痛、腹泻、便血、体重下降、肿瘤标志物升高等；待行内镜手术或外科手术；（2）排除标准：既往有结直肠肿瘤手术史或已行新辅助放化疗治疗者；过去1个月内有结肠镜检查史；半年内有急性心肌梗死病史，有严重的心肺功能不全等不适宜肠镜检查的疾病状态；正在服用抗凝药物、黄连素药物、甲基化药物等；明显血便、柏油便者。
3.干扰组：20例，包括其他疾病的非CRC患者4例、肠病治疗史患者6例（既往行内镜黏膜剥离术）以及具有CRC治疗史的患者10例（包括既往行CRC根治术患者2例与新辅助放化疗的CRC患者8例）。与初诊未治疗组为同一队列，但入选标准更为宽泛。包括非肠病的其他疾病患者，以及经过治疗的肠病患者。治疗方式包括：在粪便检测前已行CRC或癌前病变切除术、新辅助放化疗等。
1. 样本处理及检测：取肠道准备前的新鲜粪便样本进行FIT-DNA联合检测，所有粪便样本在检测过程中，其个人信息和临床诊断结果均为盲态，所有样本检测结束后集体揭盲。样本处理和核酸纯化采用FIT-DNA 检测试剂盒（常卫清®，杭州诺辉健康科技有限公司）。样本采集后1 h内进行处理，采用荧光探针法检测KRAS突变和BMP3、NDRG4基因甲基化；采用免疫法检测便潜血。核酸扩增采用Applied Biosystems®7500实时荧光定量PCR仪（美国赛默飞公司）。
2. 结果判定：采用配套的分析软件进行综合评分，该分析软件作为该试剂盒注册资料的一部分，已被中国国家医药管理局批准为二类软件（浙械注准20202210848），算法和权重因子已被锁定其中。具体计算公式是基于机器学习中的逻辑回归模型确定，阈值为165分。分值≥165分为阳性，表示受检者体内可能有CRC或进展期腺瘤，需要进一步接受肠镜检查；反之，分值<165分为阴性，表示受检者体内有CRC和进展期腺瘤的可能性低，但并不能完全排除疾病风险。
采用IBM SPSS 26.0软件进行数据分析。计数资料以频数及百分率表示。以结直肠镜或病理活检结果为金标准，采用受试者工作特征（receiver operator curves，ROC）曲线评估FIT-DNA联合检测技术对CRC及进展期腺瘤的筛查和诊断效能。双侧检验，检验水准α=0.05。
初诊未治疗组患者性别、年龄与相关的FIT-DNA联合检测结果如表1所示。86例CRC（包括早癌）患者中，FIT-DNA阳性占98.8%（85/86）；其中，69.8%（60/86）为腺癌，8.1%（7/86）是黏液癌，22.1%（19/86）为其他组织学类型。大部分患者的肿瘤位置在直肠（53.5%，46/86）和乙状结肠（18.6%，16/86），少部分患者的肿瘤位置为右半结肠（升结肠和横结肠），占11.6%（10/86）。中、低分化CRC分别占59.3%（51/86）和29.1%（25/86）。此外，0期CRC有1例，Ⅰ期CRC有15例，Ⅱ期CRC有28例，Ⅲ期CRC有36例，Ⅳ期CRC有6例，除Ⅲ期CRC的FIT-DNA阳性检出率为97.2%（35/36）外，其他分期的CRC患者中FIT-DNA阳性检出率为100.0%（50/50）。早癌组中FIT-DNA阳性检出率为7/7，其中1例分期为0期，另外6例为Ⅰ期。进展期腺瘤患者中，FIT-DNA阳性检出率为8/12。息肉患者（包括一般性息肉及非进展期腺瘤）中，FIT-DNA阳性检出率为75.8%（25/33）。表观健康组中，FIT-DNA阳性检出率为6.0%（5/84）。86例CRC患者的临床信息详见表2。
初诊未治疗组患者多靶点粪便DNA与粪便潜血（FIT-DNA）联合检测技术阳性率
初诊未治疗组患者多靶点粪便DNA与粪便潜血（FIT-DNA）联合检测技术阳性率
| 组别 | 例数 | FIT-DNA阳性率［例（%）］c |
|---|---|---|
| 结直肠癌组a | 86 | 85（98.8） |
| 性别 | ||
| 男 | 59 | 59（100.0） |
| 女 | 27 | 26（96.30） |
| 年龄（岁） | ||
| ≤49 | 13 | 13/13 |
| 50~59 | 26 | 25（96.2） |
| 60~69 | 27 | 27（100.0） |
| ≥70 | 20 | 20（100.0） |
| 早癌组 | 7 | 7/7 |
| 性别 | ||
| 男 | 5 | 5/5 |
| 女 | 2 | 2/2 |
| 年龄（岁） | ||
| ≤49 | 2 | 2/2 |
| 50~59 | 2 | 2/2 |
| 60~69 | 3 | 3/3 |
| 进展期腺瘤组 | 12 | 8/12 |
| 性别 | ||
| 男 | 10 | 7/10 |
| 女 | 2 | 1/2 |
| 年龄（岁） | ||
| ≤49 | 1 | 1/1 |
| 50~59 | 5 | 4/5 |
| 60~69 | 5 | 3/5 |
| ≥70 | 1 | 0 |
| 息肉组b | 33 | 8（24.2） |
| 性别 | ||
| 男 | 19 | 5/19 |
| 女 | 14 | 3/14 |
| 年龄（岁） | ||
| ≤49 | 10 | 0 |
| 50~59 | 8 | 3/8 |
| 60~69 | 12 | 3/12 |
| ≥70 | 3 | 2/3 |
| 表观健康组 | 84 | 5（6.0） |
| 性别 | ||
| 男 | 40 | 3（7.5） |
| 女 | 44 | 2（4.5） |
| 年龄（岁） | ||
| ≤49 | 41 | 1（2.4） |
| 50~59 | 22 | 1（4.5） |
| 60~69 | 17 | 2/17 |
| ≥70 | 4 | 1/4 |
注：a 结直肠癌组包括早癌患者；b息肉组包括一般性息肉及非进展期腺瘤患者；c分母不足20例，以绝对数比值表示
结直肠癌患者多靶点粪便DNA与粪便潜血（FIT-DNA）联合检测技术阳性率
结直肠癌患者多靶点粪便DNA与粪便潜血（FIT-DNA）联合检测技术阳性率
| 项目 | 例数 | FIT-DNA阳性率［例（%）］a |
|---|---|---|
| 恶性肿瘤家族史 | ||
| 是 | 24 | 23（95.8） |
| 否/未知 | 62 | 62（100.0） |
| 组织学类型 | ||
| 腺癌 | 60 | 59（98.3） |
| 黏液癌 | 7 | 7/7 |
| 其他 | 19 | 19/19 |
| 肿瘤位置 | ||
| 升结肠 | 8 | 8/8 |
| 横结肠 | 2 | 2/2 |
| 降结肠 | 7 | 7/7 |
| 乙状结肠 | 16 | 16/16 |
| 直肠 | 46 | 45（97.8） |
| 其他 | 7 | 7/7 |
| 淋巴结状态 | ||
| 转移 | 37 | 36（97.3） |
| 未转移/未知 | 49 | 49（100.0） |
| 肿瘤分期 | ||
| 0 | 1 | 1/1 |
| Ⅰ | 15 | 15/15 |
| Ⅱ | 28 | 28（100.0） |
| Ⅲ | 36 | 35（97.2） |
| Ⅳ | 6 | 6/6 |
| 分化程度 | ||
| 高 | 4 | 4/4 |
| 中 | 51 | 51（100.0） |
| 低 | 25 | 24（96.0） |
| 未知 | 6 | 6/6 |
注：a分母不足20例，以绝对数比值表示
评估筛查效能主要针对7例早癌患者和12例进展期腺瘤患者，这两类患者发病隐匿，无明显特异性症状，是重点高危筛查对象。FIT-DNA联合检测技术对7例早癌患者和12例进展期腺瘤患者的筛查灵敏度为78.95%（15/19），阴性预测值为96.30%（104/108）。针对早癌和进展期腺瘤的灵敏度分别为100.00%（7/7）和66.67%（8/12），阴性预测值分别为98.11%（104/106）和93.69%（104/111）。通过ROC曲线分析，FIT-DNA 联合检测技术对早癌、进展期腺瘤及总体早筛受试者的诊断效能评估，曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.982（95%CI：0.960~1.000，P<0.05）、0.758（95%CI：0.592~0.924，P<0.05）和0.841（95%CI：0.724~0.957，P<0.05）（图1），提示FIT-DNA联合检测技术对早癌的筛查能力较好。
1.结直肠进展期新生物患者：包括86例CRC患者及12例进展期腺瘤患者。FIT-DNA联合检测技术诊断结直肠进展期新生物的灵敏度为94.90%（93/98），特异度为88.89%（104/117）；其中对于CRC患者的诊断灵敏度为98.84%（85/86），对于进展期腺瘤的诊断灵敏度为66.67%（8/12）。通过ROC曲线分析，FIT-DNA 联合检测技术对CRC、进展期腺瘤和结直肠进展期新生物的诊断效能，AUC分别为0.968（95%CI：0.939~0.997，P<0.05）、0.758（95%CI：0.592~0.924，P<0.05）和0.942（95%CI：0.905~0.979，P<0.05）（图2）。提示FIT-DNA 联合检测技术对结直肠进展期新生物具有较强的诊断效能，其中对CRC的诊断效能优于进展期腺瘤。
2.纳入干扰组：为进一步分析FIT-DNA联合检测技术的诊断效能，本研究纳入了20例干扰组患者。纳入干扰组后，FIT-DNA 对结直肠进展期新生物诊断的总特异度为89.1%（114/128），对CRC和结直肠进展期新生物的诊断灵敏度分别为94.7%（90/95）、91.6%（98/107）。
在全球范围内，CRC是第三大常见癌症和第四大癌症相关死亡病因［19］。我国的CRC综合发病率和死亡率分别排第三位和第五位，且总体仍呈上升趋势［20］。研究显示，CRC在诊断时已有约 1/4 患者发生远处转移，接受治疗的患者中仍有约一半患者发生转移［21］。目前，结直肠镜与组织病理学检查是术前确诊CRC的金标准，但是由于其侵入性高，患者接受度差，导致肠镜依从性差，不能够及时有效地在早期阶段介入，从而干预癌症的发生发展［22］。FIT-DNA联合检测技术是CRC早期筛查领域的重要突破，以其无创性、高敏感性和特异性为主要优势，成为近年来该领域的热点话题。
从筛查角度分析，本研究纳入的阴性对照组、早癌和进展期腺瘤患者属于伺机性筛查人群（本院腔镜科门诊预约患者）。从辅助诊断角度分析，本研究主要纳入了CRC及经过治疗的肠病患者（结直肠外科病房待手术患者）。本研究结果为FIT-DNA联合检测技术的临床性能评估提供了重要的数据，其中对早癌和进展期腺瘤的阴性预测值分别为98.1%（104/106）和93.7%（104/111），验证了该检测技术对检测早癌及其高危癌前病变的效能，可有效帮助早期筛查，以尽早采用医疗手段干预癌症的发生发展，改善患者的预后，降低死亡率，减少国家卫生经济负担。本研究对于CRC、进展期腺瘤的诊断灵敏度分别为98.8%（85/86）和66.7%（8/12），特异度为88.9%（104/117），表明该检测技术对于辅助诊断早癌也具有较好的临床应用价值。
较既往CRC非侵入性标志物的灵敏度研究，FIT-DNA 联合检测技术在基因检测的设计上采用中国CRC患者特有的BMP3和NDRG4基因甲基化位点，能更加准确地代表中国患者的分子特征［15，23］。除了KRAS突变及BMP3/NDRG4甲基化位点的联合检测外，Lin等［24］发现，单独使用KRAS/BRAF/APC突变的CRC检出率为46.7%，对进展期腺瘤的阳性率为28.3%；SDC2/SFRP2基因位点甲基化试验发现的CRC检出率为83.8%，进展期腺瘤阳性率为72.8%；而当二者联合检测时，对CRC的诊断灵敏度为88.6%，进展期腺瘤的灵敏度为75.0%。此外，最近的报道提出粪便来源的真核RNA联合FIT试验（RNA-FIT）也可作为生物标志物，无创检测CRC及进展期腺瘤［25］。Barnell等［26］发现RNA-FIT联合检测对CRC的灵敏度为95.0%，对进展期腺瘤的灵敏度为62.0%。以上结果表明 FIT-DNA联合检测技术仍是目前CRC筛查和诊断的最具潜力的非侵入性检测工具。
此外，KRAS突变、BMP3/NDRG4甲基化试验联合FIT试验在 CRC 和进展期腺瘤中的疗效诊断中尚未见报道。本研究结果显示，一些术后患者，包括CRC根治术、早癌或进展期腺瘤的内镜下手术患者共计8例，其中6例术后治疗后转归，粪便检测结果也为阴性，1例术后治疗后复发（检测结果阳性），另外1例发生肝转移（检测结果阴性）。综合这8例患者的治疗结局，提示FIT-DNA联合检测技术对于患者的术后监测管理有一定的参考价值，可做进一步验证。本研究还观察到，在7例CRC术前新辅助放化疗的患者中，有3例患者检测结果为阴性，综合结果趋势，提示放化疗可能会影响检测结果。综合既往文献分析推断影响原因，可能与新辅助化疗后肿瘤代谢状态受到抑制有关。Zhou等［27］进行了一项前瞻性多中心研究，比较了新辅助化疗对局部晚期直肠癌患者血液中循环DNA（serial circulating tumor DNA，ctDNA）含量的影响。分析该试验数据结果，在新辅助化疗1个周期后，ctDNA阳性患者的比例明显下降，这表明新辅助化疗可以有效抑制肿瘤代谢，从而在循环系统中可检测到的肿瘤脱落DNA减少。Tie等［28］的研究结果同样证实了新辅助化疗后，局部晚期直肠癌患者ctDNA阳性的比例减少。而粪便DNA检测技术是通过检测粪便中肿瘤脱落细胞的DNA，从而得出有无癌前病变或肿瘤的结论。目前尚未有研究证实新辅助化疗后肿瘤细胞脱落进入肠道的DNA是否会减少，从上述研究推测，干扰组中经过新辅助治疗后的癌症患者，其肿瘤代谢活跃度降低，粪便中脱离的DNA片段减少，因此检测率也降低。
综上所述，本研究对多靶点粪便FIT-DNA联合检测技术进行了CRC筛查和辅助诊断的效能评估，显示其诊断效能优于筛查效能，但尚需通过后续扩大样本量进一步验证其筛查能力。
所有作者均声明不存在利益冲突
