马方综合征（Marfan syndrome，MFS）是一种常染色体显性遗传的结缔组织疾病，其发病通常与心血管系统异常有关^［1］。大多数MFS患者中存在原纤蛋白1（fibrillin-1，FBN1）基因突变^［2］，FBN1基因的突变模式多种多样，不同类型的突变可导致不同的临床表现，即使突变完全相同，患者的临床特征也不完全一致^［3］。心血管系统病变的主要表现为动脉的进行性扩张^［4］，其病理特征主要为中动脉弹性纤维层的解体、破裂等，主动脉瘤的急性破裂和出血是导致MFS患者死亡的主要原因之一^{［5, 6, 7］}。

大多数MFS是由FBN1基因突变引起的，此基因突变会导致表型发生显著变化^［8］。FBN1是一种富含半胱氨酸的分泌糖蛋白，主要作用是参与形成弹性纤维，为主动脉和其他结缔组织提供韧性^［9］。研究报道，在FBN1中已经发现超过3 000个突变，主要为FBN1蛋白中半胱氨酸替换的错义突变；其余分别为无义突变、小插入、缺失、氨基酸重复或各种类型的剪接错误^［10］。本研究针对一个三代MFS家系进行了全外显子测序（whole exons sequencing，WES），分析了支持该疾病的FBN1突变，报道如下。

1. 研究对象：2020年9月一个MFS家系先证者Ⅱa就诊于云南省第一人民医院心脏大血管外科（图1），经3位高级职称医师依据主动脉夹层诊断与治疗规范中国专家共识确诊为主动脉夹层。获得受试者及亲属知情同意并签署知情同意书后，对包括先证者在内的8名家庭成员进行临床检查。本研究经云南省第一人民医院伦理委员会审核通过（批件号：KHLL2021-KY092）。

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图1

马方综合征家系图

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图1

马方综合征家系图

2. 全外显子组测序：使用QiAAMP试剂盒从血液中提取DNA样本，并通过1%琼脂糖凝胶电泳确认其完整性。将DNA存储在0.5 ml Eppendorf试管中，在-80 ℃下进行WES。选择人类外显子V5试剂盒从1.0 μg的基因组DNA中富集外显子。首先，将基因组DNA随机分为150~200 bp的片段，然后通过在DNA片段的3′端添加“A”碱基来制备DNA文库。最后，用Illumina HiSeq 2500测序仪对DNA文库进行测序。

3. 突变基因的鉴定：本研究利用Illumina平台测序完成的结果构建Illumina PE文库，用于2×150 bp测序。首先，对获得的测序数据进行质量控制，然后利用生物信息学方法对外显子数据进行分析。获得原始测序读数后，在参考序列或参考基因组（GRCH37/HG19）存在的情况下进行信息分析过程，大致包括以下三部分：（1）测序数据质量评价：主要对测序错误率、比对率等数据量进行统计，评价数据库的构建是否符合标准，符合标准进行后续分析，否则应重建数据库或进行额外测试；（2）变异位点检测：将高质量序列与人类参考基因组进行比对，检测样本中的变异信息，对检测到的变异位点进行统计和注释；（3）突变位点筛选及与疾病相关性预测：根据突变检测结果和突变有害样本状态、基因功能和表型，通过3种分析策略筛选出与疾病相关的有害突变位点或基因。

ANNOVAR是一种科学高效的软件工具，可利用最新信息对跨多个基因组检测到的遗传变异进行功能性注释。鉴于ANNOVAR强大的注释功能和国际上的高度认可，本研究使用ANNOVAR对单核苷酸多态性（SNP）、插入和删除（InDel）、拷贝数变异（CNV）检测结果进行注释^［11］。对通过基本分析检测到的SNP/InDel信息进行突变位点筛选，具体筛选过程如下：（1）消除同义突变（不会导致氨基酸编码变化的突变），以获得对基因表达产物有影响的突变；（2）确定外显子剪接位点区（10 bp）和调控区（UTR）的变异；（3）根据SIFT、Polyphen2_HDIV、Polyphen2_HVAR和MutationTaster 预测软件的评分预测和筛选突变位点，要求至少一半的软件支持该位点的突变可能性，然后才能保留该位点；（4）过滤中国家庭群体频率数据库、Exac和Genomead群体频率数据库，保留频率<5%的突变位点，目的是去除个体间的多样性位点，获得真正可能致病的罕见突变；（5）根据家族发病率和遗传模式进行筛选。根据美国医学遗传学和基因组学学院发布的指南，对候选变异的致病性进行评估^{［12, 13］}，人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD）用于识别既往发表的文章中报道的突变。

4. Sanger测序验证：通过Sanger测序验证患者和其他家庭成员中发现的FBN1基因突变和其他潜在致病性突变。采用以下引物对突变片段进行PCR扩增：5′-ATGGAGAGTCCTGACATGCG-3′（正向）和5′-TCATAC TCAACAGAGCAGAAGAGA C-3′（反向）。将该序列与FBN1参考文献（NM_000138.4）进行比较，以确定突变^［14］。

1. MFS家系临床表现：如图1所示，该家系的8名成员中有4例MFS患者，先证者Ⅰa和Ⅱa被诊断为主动脉夹层。Ⅰa既往被诊断为Ⅲ型主动脉夹层，并于2001年在外院进行了主动脉支架植入术；Ⅱa被诊断为Ⅰ型主动脉夹层，并于2020年9月在本院接受了主动脉根部替换术和孙氏手术。临床体格检查和辅助检查均高度怀疑Ⅱc和Ⅲb为MFS患者（表1），在随后的WES和Sanger测序验证得到证实。所有患者（Ⅰa、Ⅱa、Ⅱc、Ⅲb）均有典型的MFS心血管和骨骼表现（表1）。Ⅱa具有典型的MFS心血管系统损害，包括蜘蛛指（趾）、手腕征等。Ⅱc经彩色多普勒超声心动图检查显示主动脉窦明显增宽（主动脉窦内径4.59 cm）。体格检查需排除单纯的扁平足、鸡胸、漏斗胸等。Ⅲb是Ⅱa的后代，经检查发现其存在眼球内陷、手腕征、蜘蛛指、外翻合并扁平足、漏斗胸、脊柱侧凸等临床表现（图2）。

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表1

马方综合征家系成员的临床表现

表1

马方综合征家系成员的临床表现

项目	Ⅰa	Ⅱa	Ⅱb	Ⅱc	Ⅱd	Ⅱe	Ⅲa	Ⅲb
年龄（岁）	59	33	38	35	33	39	11	7
性别	女	男	女	女	女	男	男	男
眼部系统
眼球内陷	-	-	-	-	-	-	-	+
心血管系统
主动脉根 直径（cm）	3.33	2.54	2.74	3.35	2.41	2.86	1.82	1.87
主动脉窦 内径（cm）	2.69	3.22	2.77	4.59	2.43	2.97	1.94	2.43
主动脉壁夹层 形成	+	+	-	-	-	-	-	-
骨骼系统
身高（cm）	158	182	159	165	167	176	140	128
蜘蛛指	+	+	-	+	-	-	-	+
手腕征	-	+	-	+	-	-	-	+
漏斗胸	-	-	-	+	-	-	-	+
脊柱侧凸	-	-	-	-	-	-	-	+

注：Ⅰa和Ⅱa已因心血管系统疾病行外科手术治疗（Ⅰa为术后20年复查结果，Ⅱa为术后3个月复查结果）；+：阳性；-：阴性

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图2

马方综合征家系部分患者临床体征　A：先证者Ⅱa蜘蛛指征阳性；B：先证者Ⅱa手腕征阳性；C：患者Ⅱc蜘蛛指征阳性；D：患者Ⅱc手腕征阳性；E：患者Ⅲb蜘蛛指征阳性；F：患者Ⅲb手腕征阳性

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图2

马方综合征家系部分患者临床体征　A：先证者Ⅱa蜘蛛指征阳性；B：先证者Ⅱa手腕征阳性；C：患者Ⅱc蜘蛛指征阳性；D：患者Ⅱc手腕征阳性；E：患者Ⅲb蜘蛛指征阳性；F：患者Ⅲb手腕征阳性

2. 基因突变筛选和Sanger测序结果：首先对小家族（Ⅱa、Ⅱd、Ⅲa、Ⅲb）的外周血DNA进行WES。自动筛选后，仍有1 357个候选变异需要进一步筛选。基于半自动突变筛查和解释，共发现86个染色体显性遗传变异与患者心血管系统损害相关。根据临床表现，发现Ⅱa和Ⅲb FBN1基因杂合突变c.6806 T>C（p.Ile2269Thr），此突变已被确定为与心血管系统损害患者表型相关的候选致病突变。该突变是FBN1基因位于第56外显子的错义突变位点，导致处于该位置的异亮氨酸被苏氨酸取代（p.Ile2269Thr）。检索HGMD发现FBN1基因突变是MFS已知的致病性突变^［14］，但FBN1基因c.6806 T>C国内尚未见报道。其后，使用Sanger测序验证其余家族成员。在另一位先证者Ⅰa和Ⅱc中发现该杂合突变位点（图3）。此外，MutationTaster和SIFT软件预测FBN1中的c.6806 T>C是致病的，并与疾病表型密切相关。

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图3

马方综合征家系2例先征者及其部分家属FBN1基因测序图　A：先证者Ⅰa；B：先证者Ⅱa；C：患者Ⅱc；D：患者Ⅲb

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注：4例患者均存在FBN1：NM_000138.4：exon 56：c.6806 T>C（p.Ile2269Thr）杂合子突变；红色箭头为检测出的FBN1基因突变

图3

马方综合征家系2例先征者及其部分家属FBN1基因测序图　A：先证者Ⅰa；B：先证者Ⅱa；C：患者Ⅱc；D：患者Ⅲb

MFS影响多个器官的结缔组织，包括心血管系统、眼和骨骼等^［15］。本研究结果显示，该家系三代中有4例患者经详细临床检查后被诊断为MFS。FBN1基因定位于15q21.1，全长235 kb，包含65个外显子；FBN1 mRNA包含9 749个核苷酸^［16］。FBN1蛋白是一种由2 871个氨基酸残基组成的糖蛋白，而糖蛋白是构成细胞外微纤维的主要蛋白质之一，FBN1基因突变会影响微纤维的结构和功能^［9］。本研究从患者及其家庭成员的外周血中提取基因组DNA，并通过WES检测家庭成员中的潜在突变^［17］。结果发现先证者Ⅱa的FBN1第56外显子存在1个错义突变c.6806 T>C（p.Ile2269Thr），进一步检测发现该家系中存在主动脉病变和临床表现的患者均携带相同的突变，而正常家庭成员未携带突变。1997年首次报道FBN1基因突变可致MFS，报道中该突变可导致处于该位置的异亮氨酸被苏氨酸取代，并最终影响FBN1蛋白的结构和功能，从而出现临床症状^{［14，18, 19, 20］}。本研究也确定了该突变位点，为早期诊断、预后、遗传咨询以及致病基因携带者的预防和管理提供了依据。

FBN1基因突变可引起MFS患者升主动脉扩张，进一步导致主动脉瘤和主动脉夹层，是MFS患者死亡的主要原因^［21］。MFS患者主动脉瘤和主动脉夹层的发生率随着年龄的增长而增加^［22］，虽然β受体阻滞剂和血管紧张素转化酶受体拮抗剂可降低血压，从而减缓主动脉扩张和主动脉夹层的进展，但预防性手术是目前预防MFS患者因主动脉瘤、主动脉夹层破裂猝死的最有效治疗方法。本文报道的MFS家系中，Ⅰa、Ⅱa、Ⅱc均已发病，符合典型的常染色体显性遗传。在此家系的4例患者中，Ⅱa就诊时确诊为主动脉夹层，在询问家族史时发现其母Ⅰa也为主动脉夹层，因此怀疑此家系可能具有MFS家族聚集现象，故对该家系进行临床检查和基因筛查，进一步发现Ⅱc蜘蛛指征及手腕征为阳性，且Ⅱc的彩色多普勒超声心动图结果显示主动脉窦扩张（主动脉窦内径4.59 cm），具有主动脉根部置换手术指征，确诊为MFS。对Ⅱc的外周血样本进行WES验证，也发现该相同位点的突变。该家系4例MFS患者中有3例（Ⅰa、Ⅱa、Ⅱc）出现主动脉病变，因此该突变可能与MFS患者的主动脉病变存在关联。另外，基因筛查显示Ⅲb也携带相同突变，由于Ⅲb年龄小，可能未显示出相应的临床变化，但其主动脉内径已较同龄人宽。随着年龄的增长，Ⅲb因主动脉瘤或主动脉夹层甚至急性主动脉破裂而猝死的风险逐渐增高，需要长期随访，定期评估进行预防性手术的必要性，以避免错过手术时机导致主动脉破裂或因主动脉病变引起其他损伤^［23］。

MFS患者心血管系统、眼和骨骼等结缔组织的损伤会随着年龄的增长逐渐增加，因此通过及时的临床辅助检查和基因筛查进行早期诊断和干预，对于预防患者猝死等不良事件、提高MFS家庭的生活质量和优生优育具有重要意义，值得临床医师关注。对于MFS家族成员建议进行早期检查，包括彩色多普勒超声心动图、主动脉CT血管造影（CTA）等。此外，基因检测对MFS的早期诊断、长期随访、降血压治疗和把握预防性手术时机具有重要意义^［24］。