创面是烧伤患者发生一切病理、生理变化的根本原因。烧伤引起的各种病理变化，如感染、新陈代谢加剧、体温下降、水分和蛋白质大量丢失，以及内分泌和免疫系统失调等均与皮肤屏障功能的破坏与丧失有关。烧伤治疗的最终目的是使创面愈合，并尽可能减少瘢痕形成，达到最佳的外观及功能^［1］。烧伤创面的修复方式取决于受损的面积和深度。迄今为止，早期切削痂和自体皮移植仍是修复深度烧伤创面的最佳方法^［2］。然而，大面积烧伤患者自体皮源严重不足，需要异体皮或异种皮移植以临时封闭创面，或与自体皮复合移植，为自体皮修复创面创造条件并赢得时间。近年来，由于多种原因，异体皮来源极度匮乏，临床上甚至已陷入无皮可用的境地。由于猪皮的结构功能与人皮肤相似而被广泛用于临床烧伤创面治疗，但存在免疫排斥反应和被猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retroviruses，PERV）感染的可能，因而猪皮移植难以满足临床创面治疗的需求。此外，烧伤创面存在的缺血缺氧、炎症、感染、氧化应激等也会对猪皮成活和创面组织再生修复产生影响。近年来，随着基因编辑技术的发展，采用对猪的基因进行修饰/编辑的方法可以减轻免疫排斥反应、改善创面愈合环境，为异种猪皮治疗深度烧伤创面带来新的希望。

17世纪以来，多种来源的异种皮，如猪皮、牛皮、青蛙皮、鸡皮、蜥蜴皮等，都曾被尝试用作临床创面生物敷料^［2］。其中，猪皮由于组织学结构和功能，如黏附性、通气性、胶原结构及含量等方面与人皮肤相似，且易于获取、价格低廉，成为最主要的异种皮来源，被广泛用于临床烧伤创面治疗^{［2, 3, 4］}。异种皮对烧伤创面的作用主要包括以下6个方面^{［3，5, 6］}：（1）提供干净的肉芽组织创面，为自体皮移植创造良好条件；（2）封闭创面，防止水分和蛋白质丢失；（3）作为皮肤屏障，降低创面感染率；（4）保护创面组织中的血管、神经、肌腱等活性组织；（5）减轻疼痛，利于早期康复锻炼；（6）促进创面再上皮化，提高创面愈合率。

然而，猪皮距离理想的功能性生物敷料尚有较大差距。其障碍之一是存在被PERV感染的可能性，但过去数十年来，无论是猪皮的临床应用还是将其应用于非人的灵长类动物实验，均未观察到被PERV感染的发生^{［7, 8］}。因此，创面被PERV感染的风险并不大。还有学者通过基因编辑技术敲除猪PERV基因以期进一步降低被PERV感染的可能，但该技术同时也增加了靶基因突变的可能性^{［8, 9］}。另一个障碍，也是最重要的问题，为免疫排斥反应。以往曾通过脱细胞技术或采用戊二醛处理去除猪皮免疫原性^［10］，本研究所之前也曾通过脱细胞技术在保留猪表皮的情况下对其真皮进行选择性脱细胞处理，以期达到既去除猪皮免疫原性又保留其表皮屏障功能的目的^［11］。然而这些处理都会导致猪皮失去活力，使其屏障功能受损且不具备皮肤的免疫、分泌、代谢调节等功能。猪皮移植后出现的凝血功能障碍和受体对移植物的系统性炎症反应也会对猪皮成活时间和功能的发挥产生影响。此外，猪皮制备技术的规范及质控、可能存在的细菌性感染、医学伦理等因素限制了其应用。近年来，随着基因编辑技术的发展，通过基因修饰/编辑使得去除猪皮免疫原性、调控炎症反应和凝血功能，甚至改善创面微环境并促进创面愈合成为可能。因而，基因编辑技术为异种猪皮应用研究带来了广阔前景。

皮肤作为人体最大的器官，包含淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞，具有高度免疫原性。树突状细胞是其中最主要的免疫细胞，而朗格罕细胞是最主要的树突状细胞^［12］。人体免疫系统具有良好防御机制，异种皮被移植到人体后，随着异种皮与创基血运的建立，异种抗原亦逐渐暴露于机体，引起机体中细胞和体液的免疫排斥反应：（1）细胞免疫反应，包含先天性免疫反应和适应性免疫反应，常见免疫细胞有自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞等。异种器官移植后，创面可见自然杀伤细胞和巨噬细胞浸润，自然杀伤细胞可释放溶质颗粒引起内皮细胞损伤；巨噬细胞可由异种T细胞激活，也可通过异种内皮细胞抗原和巨噬细胞表面受体相作用而激活，释放大量炎症介质，引起组织损伤^［13］。移植物表皮中，朗格罕细胞可随受体淋巴管迁入淋巴结。有研究将猪白细胞Ⅱ型抗原直接或间接递呈给人体T细胞，使CD4⁺T细胞和B细胞均被激活，从而产生免疫排斥反应^［14］。（2）超急性排斥反应，主要由α-1，3半乳糖基转移酶1（GGTA1）的产物——半乳糖-α-1，3半乳糖引起，可在移植后数分钟至数小时内发生。异种活性抗体与受体α-半乳糖结合后，补体介导的血管内皮细胞溶解或微血管损伤过程被启动，导致移植物缺血或被排斥，移植物的组织学表现为血管完整性被破坏、水肿、出血、血栓形成，以及广泛抗体和补体终末产物血管沉积^{［15, 16］}。（3）急性排斥反应或延迟排斥反应，主要由胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶的产物——N-乙酰神经氨酸抗原和β1，4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶产物——Sda抗原引起，发生于移植后1周至数月。机体表现为局部发热、肿痛和移植物功能障碍；局部组织学表现为间质出血、血栓形成、大量IgG和IgM、补体和血小板沉积，以及组织缺血坏死且多形浸润小管缺失^{［16, 17］}。（4）慢性排斥反应，通常发生于移植后数月至数年，且一旦发生，无理想的解决方法。可见，要让猪皮在人体创面较长时间存活以达到功能性覆盖的目的，就必须解决免疫排斥反应，尤其是超急性和急性排斥反应的问题。

自从首个克隆羊——多莉诞生以来，大型哺乳动物基因工程技术得到了迅速发展。最早的基因编辑技术是通过微注射方式将转移基因注入受精卵而将目标基因随机插入，即微注射转基因随机整合技术。21世纪初，同源重组和体细胞核转移技术的发展使目标基因插入的随机性降低，但体细胞基因重组效率仍然很低，限制了该2项技术的广泛应用。此后，锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶的出现极大提高了基因重组效率，但过程冗长，资源消耗大，难以普及。2014年，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统的出现使基因编辑技术出现了革命性变化，该系统在编辑特定靶向DNA时只需要1个短小的单链引导RNA，并允许多个位点被一次有效编辑，实现了高效和高保真基因编辑^［2］。最近的FokI-死亡Cas9（dCas9）技术在dCas9蛋白上附着FokI酶，采用2个dCas9可以实现基因的定位而不剪切，而FokI酶可以行使剪切功能。FokI-dCas9双锚定功能会大大降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，进而提升靶基因特异性^［18］。而且，基因编辑技术并未改变PERV-A、PERV-B、PERV-C的基因表达水平，因而不会对PERV感染产生影响^［19］。上述基因编辑技术的发展使猪的多基因编辑成为现实，除可进一步降低猪皮异种移植后免疫排斥反应、炎症反应，还可整合组织再生修复调节功能，为猪皮移植修复深度烧伤创面创造良好条件。

为降低异种器官移植后免疫排斥反应，常用的基因修饰/编辑策略包括2个大类：一是敲除、敲低负责表达异种抗原的基因，如α-半乳糖、N-羟乙酰神经氨酸、Sda、猪白细胞抗原基因或产生这些抗原的酶的基因，使移植物不表达或低表达异种抗原，从而降低受体的免疫排斥反应；二是向供体转入受体的某些基因，如CD46、CD47、CD55、CD59、血栓调节蛋白、内皮细胞蛋白C受体、血红素加氧酶1等，减轻受体补体激活、凝血和炎症反应^［5，15］。然而，目前猪的多基因编辑仍未成熟，不能完全满足猪器官异种移植的临床需求。此前曾有学者成功地对猪的9个基因进行了编辑，延长了移植器官在受体存活的时间^［9］；最近美国马里兰大学将编辑10个基因的猪心脏移植到人体，患者存活了2个月，成为异种器官移植领域的里程碑^［20］。然而，多位点基因编辑也可能导致移植器官功能不全的现象，如肾脏分泌肾素不足^［21］、移植物抗感染能力下降和非靶基因突变概率增加等^［2，22］。因此，有必要探讨更适合烧伤创面修复的异种猪基因编辑方案，在减轻免疫排斥反应和补体激活的同时，改善创面微环境，调控创面组织再生修复。

近年来，基因工程异种猪皮在创面中的应用研究已取得了很大的发展。美国马萨诸塞州总医院已于2019年获美国食品药品监督管理局批准，开展基因编辑猪皮用于治疗烧伤创面Ⅰ期临床试验^［32］，提示该技术已进入转化应用阶段，具有广阔的前景。然而，猪皮的基因编辑策略和技术尚未成熟，与烧伤创面临床治疗需求还有不小差距。从现有研究报道来看，对猪皮的基因编辑多为单基因或双基因编辑，即敲除或抑制1个或2个异种抗原基因或转入1个或2个人补体调节蛋白基因。在不使用免疫抑制剂或其他条件预处理时，基因修饰/编辑猪皮在受体创面存活时间均≤2周，其作为创面临时覆盖物尚可接受，但是距离用于大面积烧伤患者较长时间封闭创面，为自体皮源准备和微粒皮等小皮片扩展修复创面争取时间，乃至改善创面愈合微环境、促进组织再生修复的要求还有差距。因此，有必要进一步优化猪的基因编辑方案，除了敲除引起超急性排斥反应和急性排斥反应的异种抗原外，还应兼顾移植后受体补体激活、炎症反应以及创面组织细胞再生修复和微环境调控，以期达到有效封闭创面，促进创面高质量愈合的目的。