观察人胚胎肠管再通过程中阻塞管腔内的胚胎液泡的形态及黏膜上皮的形成。
对4例孕9~10周人胚胎石蜡包埋和切片进行观察。所有标本均做矢状面连续切片（5 μm厚）和HE染色。3D HISTECH扫描切片并进行三维重建。
胚胎头臀径（crow-rump length，CRL）28 mm（孕9周）肠腔可见细小腔隙，管腔形状不规则，可见黏膜上皮化，液泡离心性融合，囊壁形成黏膜上皮层。胚胎CRL 36 mm（孕10周）肠腔腔隙进一步扩大，肠腔内液泡不断融合黏膜上皮，直到完成再通。
本研究演示了人胚胎肠管再通早期的液泡形态和结构。显示肠管胚胎期液泡囊壁通过单层上皮细胞的融合、扩张和向黏膜上皮演变，构成肠道黏膜上皮。暂时充盈期肠管液泡上皮细胞和间充质细胞之间应该存在上皮-间充质转换，两者在肠黏膜上皮化和再通过程中扮演着重要作用。
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胚胎肠管再通障碍是解释小肠闭锁（Intestinal atresia, IA）病因的学说之一。该学说认为暂时充盈期肠管内的"液泡"相互融合而形成"再通"，因各种原因所致的再通停止或管腔再通不全，即形成闭锁或狭窄[4,5]。前续本课题组聚焦I型肠闭锁患儿的隔膜组织，证实出生后隔膜组织内残留和萎缩液泡的存在，并观察和描述了其形态和结构[6]。尽管如此，胚胎再通早期肠管内的液泡形态结构尚未见描述。此外，胚胎肠管再通过程中液泡与肠管黏膜上皮产生是相对独立还是同时进行的生物学过程仍不清楚。
本研究在前续研究基础上聚焦人体9~10周胚胎期肠管，采用胚胎切片和染色技术观察再通早期正常肠管内液泡的形态结构，以及肠管再贯通和肠管黏膜上皮产生过程，旨在探索正常肠管胚胎期发育过程，为肠管再通障碍学说理论提供依据和参考。
磷酸盐缓冲液、多聚甲醛，不同浓度酒精溶液购自Solarbio（中国），双蒸水自行配置。组织标本固定专用容器，包埋模具，石蜡包埋平台，切片机，HE染色平台。HE染色试剂购自Sigma（美国）。采用正置显微镜（Carl Zeiss,德国）观察和定位组织学结构。
本研究对4例胚胎（孕9~10周）进行石蜡包埋和切片，包括：1例头臀径(crown-rump length，CRL) 28 mm（妊娠9周），3例CRL 36 mm（妊娠10周）。胎龄根据孕妇末次月经结合B超检查及标本测量获得。本研究获江南大学伦理委员会批准（伦理审批号：JNU20190318IRB62）。遵守知情同意原则流产或异位妊娠后胚胎标本捐赠给大学附属医院形态学实验中心。
常规4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋成块，所有标本均作矢状面连续切片（切片厚度5 μm）。所有切片均行HE染色后中性树胶封片。观察和拍照记录。
数字切片扫描系统（3D HISTECH,匈牙利）扫描载玻片，采用Case-viewer软件读取和采集超高清二维图片。
3D HISTECH扫描完后的原始切片数据以1:16比例导出为PNG格式。使用PHOTOSHOP CS6 (Adobe Systems，美国)设置动作，将所有图像中肠腔结构批量裁剪为统一图像大小（830*830）并保存为TIFF图像格式。统一大小的序列二维图片被导入多层面三维软件Amira 6. 0. 1（Visage Imaging，澳大利亚），进行相邻图片之间的自动配准（X轴、Y轴、Z轴），对于某一层相邻图片之间配准结果不满意，采用手动进行旋转、调整。配准后二维图片导入Mimics 21. 0 (Materialise，比利时)，新建阈值，手动编辑目标结构的蒙版并逐层绘制，重建结构包括肠壁、黏膜层、胚胎液泡，不同结构在软件中分配不同颜色，设置迭代次数，以STL格式导出保存。
首先对CRL 28 mm（孕9周）胚胎观察。此期可见肠腔开始出现狭小裂隙，胚胎肠管处于再通的早期阶段。液泡散在分布间充质细胞之间，排列紧密，液泡囊壁相互融合（图1）。此外，肠腔内出现黏膜上皮，放大观察可见大量液泡囊壁偏心性向管壁融合为肠壁黏膜上皮，部分液泡囊壁正贴附和融合于黏膜上皮（图1）。对CRL 28 mm（孕9周）胚胎进行连续切片和三维重建，进一步显示黏膜组织、孤立液泡，以及正在融入黏膜的液泡（图2）。
进一步对CRL 36 mm（孕10周）胚胎观察可见随着发育肠腔内液泡数量减少，肠管腔隙进一步增大，多数液泡已经融合并演化为黏膜上皮（图1）。散在的液泡继续与肠壁黏膜上皮融合，待液泡囊壁完全变为黏膜上皮之后，肠管完成再通过程。
小肠闭锁（Intestinal atresia, IA）是新生儿外科常见疾病。病因尚不确切，胚胎肠管充盈期再通障碍和血管发育异常是解释该病病因的两个学说。当前多数学者倾向再通障碍学说，认为胚胎发育第5周胚胎肠管腔闭塞而形成肠管"暂时充盈期"，此后闭塞肠管内出现很多胚胎液泡（Vacuoles）并逐步扩大、融合和再贯通（Recanalization），产生解剖学肠腔[1,2,3]。此过程因各种原因所致的再贯通停滞或再贯通不全，即形成闭锁或狭窄[4,5]。该学说在一定程度上解释了闭锁或狭窄可发生在空肠和回肠的任何位置而无位置特异性，也是多发闭锁或狭窄的形态学基础[11]。前续本课题组聚焦新生儿Ⅰ型肠闭锁隔膜组织，通过连续切片在隔膜组织的黏膜下层内找到胚胎期残留的液泡并报道了其形态特征，为再通障碍学说提供了形态学依据[6]。尽管如此，患儿隔膜组织内残留液泡历经近32孕周的演化，液泡结构已出现囊壁裂隙，外被大量成纤维细胞，被纤维条索所包裹，残留液泡部分囊壁组织为红色坏死团块。本团队尚不清楚处于胚胎再通早期正常发育肠管以及其内液泡的形态结构。此外，尚无法明确再通的自然发育过程，也无法辨识清楚两个发育过程（胚胎肠管再贯通过程和肠管黏膜上皮产生过程）是先后进行的两个独立生物学过程，还是同时进行的生物学过程。
本研究对不同孕周龄胚胎肠管矢状面的染色观察，旨在最大程度显现发育中的肠管的纵切面结构。本研究清晰显示：①再通早期肠管被大量间充质细胞填充，内无典型间隙，肠管没有解剖学肠腔。其内大量细胞之间可见胚胎期液泡，大小不等；②随着孕周增加，液泡逐渐增大，囊壁上皮互相融合并偏心性生长，此时液泡上皮也不断向黏膜上皮融合。此期可看到肠壁结构依旧不完整，没有典型的黏膜层，黏膜下层，肌层；③随着发育和液泡不断融合形成肠管黏膜上皮层，肠腔内残留液泡逐渐减少，肠腔空隙逐渐加大，即胚胎肠管再贯通过程和肠管黏膜上皮产生过程是同时进行的生物学过程，借助胚胎肠管内液泡的融合和演化，肠管黏膜上皮逐渐形成的同时，肠腔再通也逐步完成。此外，伴随着上述黏膜形成，原始肠腔内的间充质细胞开始向黏膜下层内的血管壁组织、肌肉组织发生分化，开始出现相对典型的黏膜层，黏膜下层，肌层；肠壁结构逐步发育完善。本研究演示了孕早期阶段肠腔再通和发育，也为再通障碍学说提供了形态学依据。
肠管由内胚层和中胚层构成，内胚层分化为肠管的黏膜上皮层，而中胚层分化为黏膜下层内的血管、肠壁肌层等[12,13,14,15,16]。根据本研究结果我们提出:暂时充盈期肠管内的大量填充细胞群内应该既有上皮细胞，也有间充质细胞。发育过程中，由于相同胚层细胞具有同向聚集作用和特性[17,18,19,20]，肠管充盈期上皮细胞聚集构成液泡囊壁，并进一步融合构建出黏膜上皮细胞和腺体；而充盈期的间充质细胞分化和参与构成黏膜下层内的血管、黏膜肌层以及肠壁肌层组织等。本研究后续将聚焦暂时充盈期肠管，采用组织化学染色或免疫荧光的方法检测其内具有"干"性特征细胞，包括间充质干细胞和上皮干细胞，并进一步检测不同发育信号介导在肠管分化过程中的作用。人早期胚胎稀有和连续切片的相对珍贵，聚焦的胚胎相对少，这也是本研究的不足，课题组在后续研究中，会继续不断补充和丰富胚胎切片资源库，呈现更加完整的发育结构。
综上，本研究中观察到胚胎再通早期肠管的形态和其内液泡的结构，以及液泡囊壁不断相互融合、增大，偏心性融合贴附并形成肠管黏膜上皮的过程。在此基础上，又观察到胚胎肠管再贯通过程和肠管黏膜上皮产生过程是同时进行的两个生物学过程，借助胚胎肠管内液泡的融合和演化，肠管黏膜上皮与肠腔再通逐步完成。
所有作者均声明不存在利益冲突。
