结直肠癌（CRC）是世界第四大常见的癌症^［1］，也是死亡率第二高（仅次于肺癌）的癌症类型^［2］。以往，它在发达国家的发病率较高。但近几年，该疾病的发病率在发展中国家也显著上升。预计到2035年，全球CRC将增加2 500万新病例^{［1, 2］}。生活方式和饮食改变是CRC增发的重要因素^［3］；同时，全国范围的计划筛查和结肠镜检查也间接提高了CRC诊出率^［4］。CRC的具体病因还在探索中，目前，其风险因素则大致可归纳为年龄增长、性别、环境因素以及遗传易感性^{［5, 6］}。研究表明，一些生活方式的因素会显著增加CRC的风险，例如吸烟^［7］、过量饮酒^［8］、体重增加^［9］以及加工肉类摄入量过度^［10］。结肠微生物群研究表明，感染特定细菌种类（如具核梭杆菌和脆弱拟杆菌），也可能会增加CRC的患病风险^{［11, 12, 13］}。所有CRC患者中10%~20%具有家族阳性病史^［5］，其风险大小随受累亲属数量、程度以及CRC诊断的年龄而异^［6］。

由于遗传异质性CRC具有较高的诊断难度^［14］，系统分子分型可改善这种遗传综合征的诊断^{［15, 16］}，即共识分子亚型（CMS 1~4）^［17］。每个CMS所涉及的基因和途径都是独特的，对于诊断及治疗有重要参考意义^［18］。现阶段对于CRC的研究主要集中在肿瘤基础研究和临床转化研究两方面，它们都对CRC实验系统的开发和生物模型的建立至关重要。对于CRC不同的分子亚型，其所适应的诊断治疗选择截然不同。所以在CRC的体外模型建立中，对原发肿瘤异质性的模拟尤为关键。经典的研究模型包括肿瘤细胞系（PDC）和人源肿瘤异种移植模型（PDX）^［19］。肿瘤类器官（PDO）和肿瘤类组装体（PDA）作为两类新兴技术，在保存绝大多数原代肿瘤的生物学特征且较好地维持了肿瘤的异质性同时，也具备可多次传代长期培养的特性^{［19, 20, 21］}。PDO和PDA一方面克服了PDC模型缺乏原发肿瘤生物学特征的缺陷，另一方面简化了PDX的操作难度，节约了时间、技术和经济成本。与PDX不同，PDO和PDA也可适用于高通量的药物筛选^［22］，是两类十分适于CRC研究的优质体外模型。以下将分别对PDO和PDA做详细介绍。

肠干细胞（ISC）是已被相对完善描述的一类细胞，它作为肠癌起源细胞的假说也已被普遍接受^［23］。PDO的基础仍是干细胞分化方法，可利用的细胞型包括正常组织来源干细胞（成体、胚胎干细胞）^{［24, 25］}、诱导多能干细胞（iPSCs）^［26］和肿瘤干细胞^［22］。基于此，在1992年，用于培养3D大鼠肠道类器官的系统被开发了出来^{［27, 28］}。尽管通过使用永生化的细胞系，研究者们建立了比以前更具功能相关性的培养系统。但这种方法受限于ISC分裂的短暂性，导致已建立的培养物只能存活约1个月。2009年，Sato等^［29］发表了一种更优的方法，该方法能够生产具有较高扩展潜能和较强自我更新的肠道类器官。该类器官培养方法使用基质胶作为3D基质，在其中嵌入肠隐窝直接来源或经流式细胞分选的Lgr5⁺肠上皮细胞^［29］。以上方法很快又得到进一步优化，能够从小鼠/人类的结肠或结直肠腺瘤组织以及人类结肠干细胞中生产出长期生长的类器官^{［30, 31］}。

在上述类器官培养方案中，首先要将上皮细胞嵌入基质胶内。基质胶富含层黏连蛋白的性质模拟了体内隐窝基底的微环境，支持细胞的3D生长^［32］。此外，该系统需要使用包括支持肠隐窝结构生长和维持ISC种群的外源性生长因子的指定培养基。头蛋白（骨形态发生蛋白BMP信号通路抑制剂）是培养基中必需的添加物，因为BMP信号已被证明可抑制肠道干细胞的自我更新^［33］。表皮生长因子（EGF）是该系统所需培养基的另一个关键成分，因为它与肠上皮细胞内的增殖有关^［34］。R-spondins则是在非Wnt激活的肠上皮细胞培养类器官时所需的一种培养基补充物。R-spondins是Wnt信号通路的激活剂，它通过Lgr受体（如ISC标志物Lgr5）特异性地发挥作用，从而上调ISC群体内的Wnt信号，并能够在体内驱动隐窝增生^{［35, 36］}。除了这些生长因子，Rho激酶抑制剂Y-27632是单细胞培养所必需的，因为它已被证明可以降低分离的胚胎干细胞发生失巢凋亡的概率^［37］。有趣的是，从人类CRC样本中培养的PDO通常在没有生态位因子的情况下更容易生长，生态位因子的含量越低，表明此环境与正常人类组织微环境相似度越低，这种现象取决于临床CRC样本的突变背景以及被激活的信号通路类型^{［38, 39］}。

除干细胞分化以制备PDO的方法之外，PDA的构建是近年来提出的新兴体外模型构建方法。肿瘤类组织体的技术发展，是基于PDO的技术基础。初期，在建立体外3D培养物的过程中并未对PDO和PDA区别定义，但是随着研究的深入，发现在将不同成分分别短期培养后，组装于同一个3D体系下，以代表具有围绕基质的上皮和外部肌肉层的组织结构。这种技术率先应用于功能性神经细胞的体外3D培养^［40］。与类器官相似，类组装体的构建除了具备干性的细胞（如成体干细胞、肿瘤干细胞等）作为核心组成之外，还整合了其他细胞型，如基质成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞和肌肉细胞。Kim等^［41］利用PDO与组织基质和微环境其他成分一起重构，创建了多层膀胱PDA，并提出了“表观遗传控制肿瘤可塑性”这一机制。目前在类组装体的构建技术中，演化出通过肿瘤可见类组装体弥补了部分类器官缺陷，可以较好地模拟肿瘤相关微环境和肿瘤与周围细胞的相互作用，在肿瘤耐药、肿瘤基因漂变、肿瘤微环境免疫逃逸等方向的研究优势明显。

一些类器官（如肠道类器官）的自组装很大程度上依赖于对周围细胞的感知，细胞表面信号分子与细胞分泌型信号分子在这一过程中同等重要。环境因素的多样化在多层细胞结构的体外塑造上尤为重要。体外器官模型需要特定的细胞模式/分层来模拟目标器官^［42］。在活组织中，间充质细胞和上皮细胞产生细胞外基质（ECM）的不同成分，产生信号介质的不同浓度梯度。这些信号介质的浓度梯度对组织组装重构、伤口愈合和组织再生的调节非常重要^［43］。类器官的培养也是如此。在影响器官发育和稳态的因素中，器官3D结构的重要性已被广泛接受。在经典生物发育过程中，组织3D的架构包括组织内不同细胞类型的相应定位和分布^［44］。而在此之上，组织拓扑、细胞定位和机械力对细胞分化和成熟的影响是研究者们需进一步探究的问题，对此类组装体是新的解答工具。考虑到经典共培养系统的高度多功能性，类似的策略也已被应用于类器官培养系统的构建。而类组装体区别于共培养技术，体内相互作用的细胞可以先在体外单独培养，然后在体外/体内进行接种、组装。Transwell过滤器或图案化支架均可用于此目的，而后者显示出对特定细胞类型的选择性亲和力^［45］。笔者对上述内容及不同的培养方法进行了归类，概括为表1。它阐释了现有的主流培养方案及研究应用（表2）。

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表1

各种肿瘤研究模型的优劣对比

表1

各种肿瘤研究模型的优劣对比

培养技术	优势	缺陷
肿瘤细胞系PDC	培养体系成熟 体外扩增快	扩增过程丧失异质性 无法表达部分重要特征（如三维空间信息、细胞微环境等）
肿瘤类器官PDO/肿瘤类组装体PDA	可多次扩增 传代保真度高 培养周期适中	样本差异化较大 培养条件复杂 缺乏肿瘤微环境和机体系统性
肿瘤小鼠移植模型PDX	肿瘤异质性完好保存 体内微环境相互作用	模型构建难度大 样本质量要求高 试验周期长 经济消耗大 种属差异难以控制

注：PDC为肿瘤细胞系；PDO为肿瘤类器官；PDA为肿瘤类组装体；PDX为人源肿瘤异种移植模型

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表2

不同培养方法构建的类器官/类组装体模型示例

表2

不同培养方法构建的类器官/类组装体模型示例

体外器官模型	细胞来源				模型特点	细胞间互作	研究方向	参考文献
	aSCs	eSCs /iPSCs	分离原代细胞	细胞系
基质胶或2维单层细胞顶端
小鼠肠	√		√		具有单独分离的上皮内淋巴细胞	√	上皮内淋巴细胞与肠上皮的时空相互作用	［46］
人结直肠和肺 组织	√				使用3D生长的CRC和肺肿瘤肠样刺激来自相同患者的 PBMC		基于肿瘤特异性T细胞的靶向个体患者水平，作为个体化医疗的一种方式	［47］
小鼠肠	√		√		内嵌有分离的固有层淋巴细胞	√	益生菌对固有层淋巴细胞介导的干细胞修复和上皮屏障完整性的影响	［48］
小鼠肠	√		√		小肠隐窝、肌成纤维细胞和肌丛衍生的神经元细胞混合并嵌入ECM	√	基质细胞如成纤维细胞和神经元在肠道干细胞生态位发育中的作用	［49］
合成水凝胶
小鼠肠	√				水凝胶嵌入的3D小肠		细胞分化和 ECM 刚度的影响	［50］
	√				胶原蛋白泡沫		干细胞生物学、药物、筛选、组织工程以及再生疗法	［51］
人肠上皮细胞、单核细胞系 和原代中性 粒细胞				√	高通量形式的可降解和不可降解水凝胶		动态基质对中性粒细胞浸润到类器官的影响	［52］
人体肠道和子 宫内膜	√				具有可调生物分子和生物物理特性的ECM		ECM对ISC扩展的影响	［53］
人体小肠和大 肠	√				通过硫醇-迈克尔加成反应交联的合成水凝胶		用于持续扩展肠道类器官的新型高度可重复材料	［54］
人体肠道					合成水凝胶，无需封装即可进行 3D 人体肠道类器官培养		新的高度可重复材料允许将培养的 3D 类器官直接暴露于外源的刺激物	［55］
人和小鼠肠道 和ILC1	√	√	√		原代ILC1与肠道类器官在各种低聚合物浓度水凝胶中的共培养	√	肠上皮细胞-ILC1相互作用和ILC1对类器官干细胞生态位细胞外基质的影响	［56］
Transwell filters
小鼠肠，胃	√		√		ECM嵌入的肌成纤维细胞或肌间神经丛ENS细胞通过Transwell filters嵌入类器官内	√	上皮与肌成纤维细胞和神经的相互作用	［49］
人类肠道	√		√		涂有胶原蛋白的Transwell filters上的小肠和大肠单层细胞，在过滤器下预置有PBMC衍生的巨噬细胞	√	肠道上皮细胞-巨噬细胞相互作用和对细菌病原体感染小肠的先天免疫反应	［57］
小鼠和人类肠	√	√		√	在Transwell filters上生长的单层肠细胞汇合并转移到含有脂肪细胞的孔中	√	独立于免疫细胞的 IEC 和脂肪细胞之间的促炎信号传导	［58］
类球体与类组装体
人体肠道		√			人类iPSC内胚层衍生的肠道类器官和外胚层神经嵴细胞衍生的神经球，首先单独生长，然后作为3D球体共培养，封装在ECM中长达4~10周	√	肠道结构、血管化和功能的概括，包括肌间和黏膜下 ENS 和功能（肠道运动）	［59］
小鼠和人类肠 道	√			√	U形微孔由定义的水凝胶制成，在板中形成阵列，并接种小鼠或人类肠道类器官衍生的单细胞		在比正常培养方法更短的时间内提供均匀、可重复的类器官阵列，用于高通量检测及读数	［60］
类器官芯片（支架、蚀刻表面、微流体系统等）
小鼠肠	√				细胞支架上的单层结构		肠道生理学	［61］
人体肠道	√				使用胶原蛋白和基质胶混合物的管状可灌注微流体和支架引导系统（刚度可调节）		组织结构的生理重演以研究肠道感染疾病	［62］
人体肠道	√				支架和化学梯度		肠道干细胞生态位的结构发展	［63］
人体肠道	√			√	3D丝管状支架，在管状丝支架的腔室中播种肠小肠和在丝支架内播种的肌成纤维细胞		新的实验支架，可在体外支持肠上皮细胞生长、极化和分化	［64］

注：aSCs为成体干细胞；eSCs为胚胎干细胞；iPSCs为诱导多能干细胞；CRC为结直肠癌；PBMC为外周血单个核细胞；ECM为细胞外基质；ISC为肠干细胞；ILC为先天/固有淋巴细胞；Transwell filters为跨小室滤过系统；ENS为肠神经系统；IEC为肠上皮细胞

与体内试验相比，体外模型的最大优势之一是能够相对轻松地进行大规模药物分析，同时最大限度地减少使用动物实验的需求。这将大大减轻伦理学、经济学等方面的压力。此前，2D细胞培养在潜在的化疗药物候选物筛选方面取得了巨大进展，但受限于细胞异质性和细胞/细胞相互作用（相较于体内高交互的细胞/细胞相互作用而言）的缺乏，其结果往往与动物实验和临床测试结果差异较大。使用永生化细胞系来评估药物功效在许多方面都已趋近瓶颈，在2D细胞培养中发现有活性的药物，仅有5%能进入下一阶段临床试验^［65］。已经表明，与经典的CRC细胞系（Caco-2、MC38）二维药筛结果相比，类器官模型在预测小鼠肠上皮细胞（小鼠模型）对5-氟尿嘧啶（5-FU）的凋亡反应方面更加准确^［66］。

除此之外，也有研究表明相比等效的2D培养物，由胰腺导管腺癌形成的3D球体能够以更具生理相关性的方式产生化学抗性^［67］。由于化学抗性的产生和发展是CRC患者药物干预效用的一个重要限制因素，因此该系统还可以为CRC研究提供与动物实验和临床测试功能更相关的模型。人们认为3D细胞培养提供了比2D细胞培养更准确的模型，这是因为细胞之间的物理力和空间相互作用在许多细胞信号通路中发挥着重要作用^［68］。

肿瘤的高度异质性是目前肿瘤耐药的关键因素^［69］，也是肿瘤治疗方法有待突破的瓶颈。PDO和PDA能很好地模拟体内肿瘤微环境，并在此基础上进行大规模药筛。这或将能够克服基于肿瘤细胞系和动物模型的传统药筛方法的缺陷^［70］。例如，van de Wetering等^［22］于2015年利用自行构建的结肠癌PDO样本库，率先使用PDO进行大规模药物筛选，并指出PDO是未来体外肿瘤药敏试验的首选，其应用于个性化治疗方案设计的潜力极大。在Hill等^［71］的研究中，使用了来源于高级别浆液型卵巢癌并发腹膜/结直肠转移患者的PDO对卡铂、Prexasertib、VE-822、吉西他滨和奥拉帕利等多种抗肿瘤药物进行了高通量筛选。他们发现不同药物组合的逆转DNA损伤修复缺陷的效率不同，而且筛选所得的高效药物组合，对于不含潜在DNA修复缺陷的肿瘤病例也有一定治疗效果。类器官的短期培养是快速测试这些组合的有用模型。Huang等^［72］将胰腺导管癌PDO引入药物测试，证实了PDO是个性化药物测试的良好平台。随后，他们还对两种胰腺癌新药进行了评估，发现其中一种名为NNC1999的新型EZH抑制剂有显著疗效，进一步说明了PDO是高通量药物筛选和个体化治疗研究的优良载体。

随着培养载体和培养技术的更新，PDO和PDA在肿瘤研究领域用途获得了极大的拓展。这包括在类器官和类组装体体系的免疫治疗探究、PDO和PDA的联合液体活检、结合基因编辑技术扩展类器官和类组装体表型和生物用途等。上述研究不仅提高了类器官和类组装体本身对在体肿瘤的模拟性，同样使大规模药筛、高通量测序的结果更为可信且贴近临床患者，大大提高了临床转化的可行性。

基于嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的血液系统肿瘤治疗因能准确识别癌细胞受体并杀伤肿瘤而备受关注。然而，包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）抑制剂、程序性细胞死亡受体1（PD-1）抑制剂、程序性细胞死亡配体1（PD-L1）抑制剂、单克隆抗体、T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）和CAR-T疗法在内的免疫治疗在其他实体肿瘤中的应用^{［73, 74, 75, 76, 77］}，具有很大的局限性。治疗靶向性的欠缺也是免疫疗法在体内产生毒性及不良反应的主要原因。传统的体外模型无法模拟免疫疗法对患者的不良反应。建立有效的临床前评价系统，对推广免疫疗法迫在眉睫。PDO和PDA因其对来源组织的高保真的、较完善的还原过程，在体外还原了肿瘤的特异性抗原。同时，其培养周期短，取材方便，可很好地完成免疫治疗临床前检测的任务。Gao等^［78］使用转移性前列腺癌患者的组织样本成功构建了7个PDO，其中1个便来源于患者的循环肿瘤细胞（CTC）。此外，PDO和PDA结合液体活检技术，也将在肿瘤患者的发现、诊断、治疗和预后评价等各个临床进程中发挥作用。Matano等^［38］使用CRISPR-Cas9系统对结肠类器官进行基因编辑，涉及Apc、Smad4、Tp53、Kras及Pik3ca多个抑癌/原癌基因，结合培养体系的配合，获得了众多不同表型的结肠癌PDO模型。它们可用于研究包括拷贝数异常、表观遗传学异常、代谢组学异常等情况诱发肿瘤的内在机制。可以预见，在不远的未来，基因编辑与类器官/类组装体培养技术的结合，将是未来完善类器官/类组装体生物样本库的有效手段。

长久以来，药物进入临床研究前需要在动物模型上验证有效性和安全性，然而，如前所述，动物模型在模拟度和动物实验伦理层面面临着巨大的挑战。有数据显示，约92%在动物实验中证明了安全、有效的药物，却在临床试验中失败^{［79, 80, 81］}。因此无论是国内的上市前药物三期临床试验，还是国际上的美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）都通过不断修正的监管法案，缩减动物模型的应用数量。2022年7月美国众议院通过《2022年食品和药品修正案（H.R.7667-Food and Drug Amendments of 2022）》，本次修订法案的推出，显示了FDA对于新兴技术用于新药研发的积极态度，同时也确定了器官芯片/微生理系统作为非临床试验研究模型的重要地位。其中针对FFDCA（21 U.S.C. 355）药物开发相关条款进行了两项重要调整：（1）将原本的法案中“动物实验”统一修订为“非临床试验”，削减了传统认知中将“动物实验”等同于“临床前试验”的强关联性。（2）首次将器官芯片和微生理系统作为独立的药物非临床试验评估体系纳入法案。其中PDO/PDA作为临床前试验的重要技术手段，在体外模拟、器官芯片的发展中有着举足轻重的地位，我们希望借助这种人源体系、高仿生、高通量创新模型，为药物的早期研发和临床转化带来革命性的突破。

虽然类器官/类组装体模型已经在多个研究领域展现出优势，其仍有一些亟待改进的缺陷。如缺乏免疫细胞的浸润与互作、培养标准尚未完全统一、患者PDO表型有限且成功率低等^［82］。这些问题的解决，需要生命科学、临床医学、生物医学工程、材料科学多方协作以求改进。