哮喘-慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）重叠（ACO）是临床上常见的一种疾病表型，患者兼有哮喘与慢阻肺的临床特征。由于ACO尚无统一的诊断标准，临床上早期诊断和规范治疗ACO患者往往存在困难。寻找到高特异度、灵敏度、无创易获得的生物标志物能够辅助ACO患者的早期诊断，指导治疗方案并改善患者预后。从哮喘与慢阻肺的病生理变化出发，发现了中性粒细胞、Th2型炎症相关分子及小分子代谢物、微小RNA等多种有价值的生物标志物。
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哮喘和慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是常见的慢性气道炎症性疾病，哮喘-慢阻肺重叠（asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap，ACO）描述了兼有这两种疾病临床特征的一种疾病表型。流行病学研究显示，哮喘患者的ACO患病率约为26.5%，而在慢阻肺人群中患病率约为29.6%［1］。相较于单纯的哮喘和慢阻肺患者，ACO患者的急性加重风险更高、生活质量更差、肺功能降低更明显、死亡率更高［2］。尽管ACO是临床实践中常见的疾病表型且给患者带来较大的负担，但目前对ACO的认识和研究并不充分，例如在ACO的诊断标准、ACO是单一的疾病实体还是异质性的疾病叠加所表现出的表型等关键问题上尚未达成共识，对ACO的明确诊断和规范治疗造成困难。
为此，全球哮喘防治倡议（Global Initiative for Asthma，GINA）呼吁在ACO的临床表现、病生理机制、生物标志物等方面投入更多的研究。明确ACO的生物标志物除有助于回答上述几个关键问题外，在临床上还能够应用于ACO患者的早期筛查并指导治疗，有望减轻患者的疾病负担、提高生活质量并改善预后。
关于ACO发病机制的讨论由来已久，目前尚无统一的说法。1961年，荷兰学者Dick Orie提出了著名的荷兰假说，认为哮喘、慢性支气管炎、肺气肿等并不应被视为独立的疾病，而是同一疾病实体的不同表现形式，这一疾病实体被称为慢性非特异性肺病（chronic nonspecific lung disease，CNSLD）。CNSLD被认为是患者在气道高反应性、过敏等内源性特质的基础上受污染物、过敏原、病原体等外源性因素作用的结果。依外源性因素作用的性质、时间跨度不同，CNSLD可有不同的表现［3］：具有特定遗传特质的个体暴露于过敏原则发展为哮喘，暴露于吸烟则发展为慢阻肺，兼有这两种暴露因素时，就可能发展为ACO。Charles Fletcher则于1965年提出了英国假说，认为哮喘与慢阻肺是由不同病因通过不同机制导致的不同疾病实体。在ACO患者的发病过程中，存在着复杂的交叉作用，吸烟促进了哮喘的发展，过敏原接触也促进了慢阻肺的发展［4］。除以上两种学说外，近二十年来，学者还观察到严重哮喘患者具有与慢阻肺患者相似的炎症模式、临床表现和糖皮质激素治疗反应性，认为ACO可能是严重哮喘的一种表型，这可能是由于早发的哮喘通过气道重塑造成了不可逆的气道阻塞［5, 6, 7］。
目前全球尚无通用的ACO诊断标准，但部分地区、部分组织给出了专家共识（表1）。2015年，GINA和慢阻肺全球防治创议（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）推出了联合指南［8］，认为在确定患者患有慢性气道疾病后，考虑患者在发病年龄、呼吸系统症状、肺功能、病程等方面的特征，如果支持哮喘和慢阻肺的特征数相近，可初步诊断为哮喘-慢阻肺重叠综合征。需要注意的是，2017年起，GINA指南将“哮喘-慢阻肺重叠综合征”改称为“哮喘-慢阻肺重叠”［9］，以强调ACO是具有异质性的临床表型，而非单个疾病实体。除GINA标准外，还有2012年与2017年两版西班牙专家共识［10, 11］、2016年北美、西欧、亚洲联合专家共识［12］的诊断标准。各研究参考的诊断标准不尽相同，不可避免地存在选择偏倚，选取的ACO患者存在一定的异质性，这是同一生物标志物在不同研究之间表现出不同诊断效能的重要原因。
哮喘-慢阻肺重叠（ACO）诊断标准专家共识
哮喘-慢阻肺重叠（ACO）诊断标准专家共识
| 专家共识 | 诊断标准 |
|---|---|
| ·2012年西班牙专家共识［10］ | ·满足2个主要标准或1个主要标准和2个次要标准：主要标准：（1）支气管舒张试验强阳性；（2）痰中嗜酸粒细胞（EOS）升高；（3）40岁以前的哮喘史次要标准：（1）总IgE升高；（2）过敏史；（3）≥2次的支气管舒张试验阳性 |
| ·2017年西班牙专家共识［11］ | ·ACO诊断流程： 第一步：≥35岁人群，吸烟或既往吸烟，存在慢性持续的气流受限：支气管扩张剂后第1秒用力呼气容积与用力肺活量的比值（FEV1/FVC）<0.70；第二步：现症哮喘的诊断：（a）支持哮喘诊断的个人史、家族史和（或）临床症状；或（b）客观的辅助诊断：支气管舒张试验阳性，或峰流速日变异率≥20%，或呼出气一氧化氮浓度≥50 ppb（1 ppb=1×10-9）；第三步：如果现症哮喘的诊断不能建立，则需满足支气管舒张试验强阳性和（或）血EOS数≥300/μl |
| ·2016年北美、西欧、亚洲专家共识［12］ | ·满足所有主要标准和至少1个次要标准： 主要标准：（1）≥40岁人群持续的气流受限：支气管扩张剂后FEV1/FVC<0.70或正常下限；（2）吸烟指数≥200或等价的空气污染接触史；（3）40岁以前诊断的哮喘或支气管舒张试验强阳性 次要标准：（1）既往过敏史或过敏性鼻炎史；（2）≥2次的支气管舒张试验阳性；（3）血EOS数≥300/μl |
哮喘与慢阻肺具有某些相似的临床特征，但二者呼吸系统炎症的模式却有着显著的差异。一般来说，巨噬细胞、中性粒细胞和1型辅助T细胞（Th1）细胞的局部浸润以及白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-8、IL-9、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等细胞因子的水平升高是慢阻肺的特征；与慢阻肺不同，哮喘则是由IL-4、IL-5、IL-6等Th2型细胞因子驱动的以嗜酸粒细胞（Eosinophils，EOS）为主的炎症［7］。ACO可能兼有慢阻肺和哮喘的炎症特征，能够反映ACO患者炎症状况的细胞因子、代谢物均有潜力成为ACO的生物标志物。
1. 细胞因子：IL-8是中性粒细胞趋化因子，是慢阻肺患者的中性粒细胞型炎症中重要的炎症介质，进入人体气道的烟尘等污染物可刺激巨噬细胞、上皮细胞等分泌IL-8，趋化并激活中性粒细胞参与后续的炎症反应。Ding等［13］测定了ACO患者与非ACO哮喘患者的血清IL-8水平，发现ACO患者的血清IL-8水平显著低于非ACO的哮喘患者，且IL-8以167.5 ng/L为界值时可以以80%的灵敏度从哮喘患者中区分出ACO患者。ACO患者的IL-8水平低于哮喘患者，提示ACO的炎症可能不是慢阻肺的中性粒细胞型炎症和哮喘的Th2型炎症的重叠，ACO可能存在着独特的发病机制。但Huang等［14］的研究报道了与之矛盾的结果：ACO患者血浆的IL-8水平高于哮喘患者。ACO患者的IL-8水平变化，还需要在更大的人群中进一步研究。
Ding等［13］还测定了ACO患者血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的水平，VEGF具有促肺泡细胞存活、保持肺泡上皮完整性、介导缺氧条件下的新血管生成等生理效应，是参与慢阻肺患者炎症反应的重要细胞因子。在VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D等因子中，VEGF-A具有成为ACO生物标志物的潜力，在界值为909.85 ng/L时以80.8%的特异度从哮喘患者中区分出ACO患者。
2. 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）：NGAL已被证明可作为慢阻肺的生物标志物，且与慢阻肺患者的GOLD分级相关［15］。在慢阻肺患者的呼吸系统中，中性粒细胞与气道上皮细胞分泌的NGAL可与基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotease 9，MMP-9）结合而阻止其失活，导致持续性的胶原降解和肺损伤［15］。Mihaylov等［16］和Wang等［17］均报道了ACO患者的血浆NGAL水平高于哮喘患者，在后者的研究中，血浆NGAL为ACO灵敏的生物标志物，界值为104.7 μg/L时从哮喘患者中筛出ACO患者具有92.74%的灵敏度。Iwamoto等［18］在诱导痰中也验证了ACO患者相较于哮喘患者NGAL水平的升高，4.2 mg/L为痰中NGAL最佳界值，可以以81.8%的灵敏度和80%的特异度区分ACO与哮喘患者。
3. 中性粒细胞-淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）：外周血NLR易获得、成本低，已经得到越来越广泛的研究。在慢阻肺患者中，高NLR者具有更高的感染和急性加重风险、更差的预后和更高的死亡率［19］。Islam等［20］的研究显示，相较于慢阻肺患者，ACO患者的NLR水平较低，NLR可以0.815的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积（area under curve，AUC）用于二者的区分。Li等［21］和Gava等［22］也注意到ACO患者的NLR较低的现象，并将其解释为ACO患者血淋巴细胞计数升高导致的NLR降低，但ACO与慢阻肺两组患者NLR水平的差异过小，并不支持其作为辅助ACO诊断的工具。
1. EOS：EOS是哮喘Th2炎症中重要的炎症细胞，多个共识已经将血/痰EOS增多纳入ACO的诊断标准中，外周血EOS>300/μl被认为是诊断ACO适宜的界值［23］，在指导慢性气道疾病的治疗上，EOS计数也有重大意义。荟萃分析显示，EOS>200/μl是吸入性糖皮质激素治疗降低慢阻肺患者全要素死亡率的最强预测因子［24］。有2项不以血EOS增多作为ACO诊断标准的研究均报道了ACO患者的血EOS高于慢阻肺患者［25, 26］。Li等［21］的研究中，在335/μl为界值时血EOS可以高特异度（90.3%）在慢阻肺患者中筛选出ACO患者，但其灵敏度较低（39.6%），单独应用效果不佳。尽管EOS已被公认为ACO的生物标志物，但各共识多将EOS作为ACO诊断的次要标准，还需要结合临床症状、气道可逆性等进行综合评估。
2. 呼出气一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）：FeNO是哮喘最重要的生物标志物之一，可用于表征患者气道的Th2型炎症水平、辅助哮喘的诊断、预测哮喘患者糖皮质激素治疗的反应性和哮喘恶化的风险［27］，现已在哮喘的诊疗中得到广泛的应用。得益于FeNO在哮喘治疗领域取得的巨大成功，FeNO作为ACO可能的生物标志物的应用得到了广泛的研究。一项荟萃分析统计了10篇文献共1 335例研究对象得出：ACO患者的FeNO水平较慢阻肺患者高出11.15 ppb（1 ppb=1×10-9），FeNO用于ACO和慢阻肺区分的灵敏度和特异度均为71%，提示利用FeNO从慢阻肺患者中筛查出ACO患者具有中等的效力［28］。
FeNO的意义并不局限于作为辅助诊断ACO的工具，文献已报道高FeNO水平预示着慢阻肺患者的更高的急性加重风险［29］，但针对ACO患者尚缺乏相关的研究。随着对ACO研究的进一步深入，FeNO作为预测ACO患者预后、指导治疗方案的工具，有望得到进一步的应用。
3. YKL-40：YKL-40蛋白是在巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等细胞中广泛表达的炎症因子，具有促进T细胞向Th2细胞类型分化、促细胞增殖与存活，促组织重塑和血管再生等生理功能，已报道血浆YKL-40可作为克罗恩病等炎症性疾病和多种癌症的生物标志物［30］。
有文献先后报道了慢阻肺患者的血清YKL-40水平高于ACO患者，而ACO患者的血清YKL-40水平又高于哮喘患者的现象［17，31, 32, 33］，Gon等［31］和Shirai等［32］报道的将YKL-40用于ACO和哮喘区分的AUC分别为0.687和0.71，但ACO与慢阻肺患者之间YKL-40水平的差异并不显著，Wang等［17］报道的将YKL-40用于ACO与慢阻肺区分的AUC为0.71，但ACO与哮喘患者之间的差异也不显著。
除哮喘和慢阻肺外，年龄等基本状况和气道外的疾病都可能对个体的血浆YKL-40水平产生影响［30］，实际应用中YKL-40用于特定疾病检测的准确性将低于文献所报道。总的来说，YKL-40类似于C-反应蛋白，更适于作为全身炎症的反映，要将其作为ACO的生物标志物，还需要更多的证据。
4. 骨膜素：骨膜素是参与Th2炎症反应过程的一种胞外基质蛋白，哮喘患者气道中高水平的IL-4和IL-13均可刺激成纤维细胞上调骨膜素的表达，之后高表达的骨膜素被分泌到细胞外并沉积在气道上皮的基底膜中，参与气道重塑过程。血清骨膜素作为生物标志物有如下两个优点：一是病变局部的骨膜素会持续释放到血清中，可稳定检出；二是血清中骨膜素的基底水平（约50 μg/L）低，局部释放的骨膜素增加将使血清骨膜素水平明显升高［34］。
Shirai等［32］研究发现，哮喘患者与ACO患者的血清骨膜素水平相近（分别为59.0 μg/L和59.8 μg/L），都显著高于慢阻肺患者（52.8 μg/L），同时具有高YKL-40蛋白水平和高骨膜素水平的人群患ACO的风险是其他人群的2.59倍。但有两项研究均报道了与之不同的结果：一项工作显示，ACO患者与慢阻肺患者的骨膜素水平相近（分别为36.6 U/ml和36.5 U/ml），均显著低于哮喘患者（41.5 U/ml）［35］；另一项工作则显示三种患者的骨膜素水平相近，无显著性差异，血清骨膜素水平不适宜作为区分三类患者的工具［36］。
1. 组氨酸：组氨酸是一种潜在的炎症代谢物，作为组胺的前体，其在Th2炎症反应和气道平滑肌收缩中发挥重要的生理效应［37］。Oh等［38］使用了液相色谱-质谱法测量了ACO、慢阻肺和哮喘三组共107例患者的尿L-组氨酸水平，显示ACO患者的尿L-组氨酸水平显著高于哮喘和慢阻肺患者，组氨酸在最佳界值时可以75.7%的灵敏度和63.0%的特异度在三组患者中区分出ACO患者。
2. 类花生酸类代谢物：类花生酸是20碳多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）的氧化衍生物，PUFAs从细胞膜磷脂上被释放出，后在不同的氧化酶系作用下氧化成为类花生酸，类花生酸与哮喘气道中扮演着类似细胞因子的生理作用，参与支气管收缩、气道重塑等过程［39］。Cai等［40］测定ACO患者的类花生酸类代谢物水平，发现相较于慢阻肺患者，ACO患者的12（S）-过氧羟基二十四碳四烯酸［12(S)-hydroperoxyeicosatetraenoic acid，12(S)-HPETE］等类花生酸水平较高，并且部分类花生酸和FEV1与用力肺活量（forced vital capacity，FVC）的比值之间存在负相关关系，15(S)-羟基花生四烯酸［15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acids，15(S)-HETE］和12(S)-HETE用于ACO和慢阻肺区分的AUC高达0.96和0.93，为各研究报道的生物标志物中最高值。
3. 其他代谢物：Ghosh等［41, 42］分别通过核磁共振氢谱（NMR）和气相色谱-质谱（GC-MS）分析了ACO患者血清及呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）中的代谢物。NMR方法发现ACO患者血清中的缬氨酸、谷氨酸和柠檬酸水平较哮喘和慢阻肺患者均有显著降低，且其水平与患者的FEV1和FEV1/FVC两个临床指标呈正相关关系［41］，而在EBC中发现丙酮、异丙醇、缬氨酸等分子水平存在差异［42］；GC-MS方法在血清中发现丝氨酸、苏氨酸等11种差异代谢物，且对85种可量化检测的代谢物进行通路富集分析，发现代谢物被显著富集到氨基糖和核糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生等通路中［33］。
miRNA是在转录后水平负性调节基因表达的长约22个核苷酸的RNA片段，其在血浆等液体中具有良好的稳定性，是具有潜力的疾病血清生物标志物。
Hirai等［43］测定了血浆中84种miRNA的水平，发现miR-223-3p、miR-15b-5p等5种miRNA在ACO患者与慢阻肺患者之间、ACO患者与哮喘患者之间均有明显的表达差异，其中miR-15b-5p片段在区分ACO、慢阻肺和哮喘三种不同类型的患者中表现最好，将该片段用于三种类型患者的多分类logistic回归分析AUC为0.71，而将miR-15b-5p与血清骨膜素、YKL-40蛋白联合应用AUC可达0.8。Rodrigo-Muñoz等［44］的研究则发现miR-320、miR-185-p和miR-1246在哮喘患者与ACO患者之间存在差异表达，三者的联用应用可以较高的准确度（AUC为0.91）在哮喘患者中区分出ACO患者。
Asensio等［45］认为EOS升高型慢阻肺（chronic obstructive pulmonary disease with eosinophilia，COPDe）和吸烟型哮喘是ACO的两种亚型，进行这两种亚型和无吸烟型哮喘、无EOS升高型慢阻肺共四种疾病表型的血清miRNA微阵列分析，发现COPDe患者的血清miR-619-5p和miR-4486水平显著低于其他三种表型，两种miRNA用于COPDe与其他表型区分的AUC分别为0.63和0.61，结合年龄、血EOS计数、支气管扩张剂后FEV1改善率等指标进行logistic回归分析后AUC提高至0.768，分类准确性得到进一步提高。
上述各研究对差异miRNA的靶基因进行通路富集分析，都将靶基因富集到MAPK、PI3K-AKT、ErbB2通路上。提示miRNA不仅自身可作为生物标志物，从miRNA的靶基因切入，还有望发掘下游的mRNA、蛋白质作为生物标志物，并此基础上进一步阐明ACO的发病机制。
目前已经研究发现多种具有潜力的ACO生物标志物，其中不乏能够在一定程度上鉴别ACO、慢阻肺和哮喘的分子，但还需要更多的研究对其诊断效能进行验证。前沿的样本检测分析技术是助力生物标志物寻找的有力工具，如已有学者借助组学技术对ACO的代谢组学、miRNA组学进行研究，通过组学技术寻找多个适宜的生物标志物并联合应用，可提高诊断的准确性、提高对异质性的ACO群体的鉴别能力。除此以外，经口呼出的生物标志物如FeNO、呼出气冷凝液也是富有潜力的研究方向，相较于传统的血液标本，其可无创获得并且直接反映气道的病理状态，具有独到的优势。随着对ACO研究的不断深入以及新的检测分析技术得到更加广泛且合理的应用，期待未来能够发现具有高诊断效能且成本低、易获得的生物标志物，真正服务于临床。
陈海杰, 周雨缪, 张静, 等. 哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠生物标志物研究进展[J]. 中华健康管理学杂志, 2023, 17(5): 395-400. DOI: 10.3760/cma.j.cn115624-20221109-00821.
所有作者声明无利益冲突
1. 基于目前的研究结果，下列关于哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠的说法不正确的是（）
A. 是具有异质性的临床表型
B. 是同一病因导致的两种不同疾病表型的叠加
C. 患者常兼有哮喘和慢阻肺的临床表现
D. 目前尚无统一的诊断标准
2. 下列与哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠的发病无显著相关的因素是（）
A. 吸烟
B. 遗传因素
C. 过敏原接触
D. 低盐饮食
3. 慢性阻塞性肺疾病的中性粒细胞炎症常伴有以下哪种生物标志物水平的升高（）
A. IL-8
B. IgE
C. IL-4
D. IL-5
4. 呼出气一氧化氮在哮喘诊疗中的作用不包括（）
A. 确诊哮喘
B. 辅助哮喘的诊断
C. 预测哮喘患者对吸入性糖皮质激素治疗的反应性
D. 监测哮喘患者气道炎症水平
5. 临床上理想的生物标志物的要求通常不包括（）
A. 灵敏度高
B. 特异度高
C. 易获得
D. 可用试纸进行自测
