尽管PGT在ART中的应用已有20多年，但该方法在诊断准确性和安全性方面仍然存在许多问题。

第一，PGT的有效性存在争议，有研究显示与仅通过形态学选择胚胎移植的对照组相比，PGT虽然能降低流产率，但没有显著提高25~40岁女性每次单个整倍体胚胎移植的持续妊娠率和活产率^{［3, 4］}。第二，滋养层细胞（TE）是形成胎盘的谱系，虽然有研究报道了TE和内细胞团（ICM）之间的一致性^{［5, 6, 7］}，但也有研究者提出整倍体细胞会优先分配给ICM的假设^［8］，以及人类囊胚期胚胎中检测到的广泛的染色体嵌合现象，进一步影响了仅使用5~10个TE活检细胞的PGT结果的可靠性和准确性^［9］。嵌合现象的存在可能与二代测序（NGS）平台的较高敏感性和TE活检本身有关^{［10, 11］}。因此通过TE活检的PGT可能会导致遗传误诊，即假阳性或假阴性。已有研究报道移植嵌合体胚胎后生育了健康后代^［12］。第三，活检操作（如活检细胞的数量和标本从胚胎中分离的方法）还没有标准化，不同实验室之间存在差异。TE活检的细胞数量可能还会影响植入率^［13］。并且最重要的是活检操作是有创的，对胚胎的植入潜力甚至后代健康的长期潜在影响仍不确定。研究发现胚胎活检可能会影响小鼠胎儿的肾上腺或神经管发育，增加肝相关胰岛素抵抗的风险，并影响成年小鼠的体重和行为^{［14, 15, 16］}。虽然没有统计学意义，但Zhang等^［17］也发现TE活检PGT妊娠期发生先兆子痫的概率增加3倍（10.5%比4.1%），同时还增加了前置胎盘的风险。第四，NGS结合TE活检是目前PGT应用最广泛的方法。它需要胚胎学家们使用专门的设备进行操作培训并积累经验，这将会大大增加成本。因此，人们越来越关注于使用无创的方法来检测植入前胚胎的遗传学信息。

孕妇血浆中胎儿游离脱氧核糖核酸的发现，可允许在孕早期更安全地检测胎儿的遗传信息情况，为产前检查的转变提供了一种新的模式。随后，在羊水、卵黄囊、胚胎的废弃培养液（SCM）中也发现了cfDNA的存在。正如母体血清中的胎儿cfDNA来源于胎盘滋养层一样，胚胎cfDNA的发现为胚胎植入前遗传学评估提供了一种新的策略——niPGT。

Palini等^［18］于2013年首次通过实时荧光定量PCR技术成功扩增囊胚腔液（BF）中的微量cfDNA来鉴定X-连锁疾病相关的胚胎。随后，Shamonki等^［19］于2016年首次证明了cfDNA存在于第3天卵裂期胚胎培养至第5~6天囊胚期胚胎的SCM中。大部分SCM样本（55/57）均能成功扩增，但只有2个SCM样本提供了足够量的cfDNA来诊断胚胎的非整倍体信息，2个样本与TE活检结果完全一致。近年来以TE活检细胞作为参考样本的研究结果显示，SCM样本的信息率（即可诊断的SCM样本百分比）和倍性一致率分别在62.7%~97.6%和33.3%~89.1%之间^{［19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32］}。Feichtinger等^［33］以极体活检为参考样本，结果显示了81.8%的信息率和72.2%的倍性一致率，但该研究存在缺少父系染色体信息等局限性。有两项研究以金标准整个囊胚（WB）为参考样本。Xu等^［34］将42个第3天胚胎复苏并培养至第5天，样本信息率为100%，但倍性一致率只有85.7%。而Yin等^［35］复苏了75个经TE活检的第5~6天囊胚，培养24 h后收集样本，虽然信息率仅为78.7%，但倍性一致率为89.8%。还有4个研究小组同时比较了SCM与TE和WB（分别为33、48、16和256个囊胚），获得了高信息率（分别为97.6%、92.3%、95%和96.6%），但不同的倍性一致率（分别为45.5%、93.8%、93.8%和78.1%）^{［21, 22，27，29］}。不同的参考样本产生了不同的信息率和一致率，且niPGT的敏感性和特异性在不同的研究中也有所不同，这引起了研究者对niPGT作为一种胚胎植入前遗传学评估方法的诊断有效性的质疑。

为了提高培养液中cfDNA的含量，有些研究通过激光打孔使囊胚皱缩，然后将SCM与BF结合进行分析，结果显示，SCM+BF的信息率为87.5%~100.0%，与TE或WB的倍性一致率分别为76.3%~100.0%和70.4%~100.0%^{［12，30，36, 37, 38, 39, 40, 41］}。这种微创的方法并不具有优势，因为没有得到比分析培养液本身更好的结果，而且研究显示BF的去除可能会影响囊胚与其周围环境之间的细胞间通信^［42］。

大量的研究证明了niPGT潜在的临床应用，但结果的差异性限制了其被引入临床领域。患者背景、培养基污染、不同的培养方法（培养液滴量和收集样本时间）、胚胎操作（脱颗粒细胞、辅助孵化、活检和玻璃化冷冻）或DNA分析（扩增方法、测序方法和诊断算法）等都可能是引起结果差异的因素。另一方面，嵌合体胚胎的存在也可能会干扰niPGT的检测^［43］。嵌合现象是人类早期胚胎发育的共同特征，可能来源于有丝分裂或减数分裂中发生的分离错误。因此，从嵌合体胚胎的SCM样本中获得的遗传物质可能会出现假阳性的结果。

虽然SCM中存在可检测到的cfDNA，但其起源尚未完全了解，TE和ICM都是潜在的来源。目前关于cfDNA的产生机制，主要有两个假设。

其中一种观点认为胚胎产生和释放cfDNA可能是作为一种与子宫内膜沟通的方式，通过与其他物质（如microRNAs）结合来完成胚胎发育和植入期间的信号传递^［44］。另一种观点则认为，cfDNA可能来自胚胎发育早期的细胞凋亡或坏死^［22］。早期的研究发现，与整倍体胚胎相比，嵌合体胚胎的细胞增殖和死亡增加，并与多次TE活检结果的一致性非常低，证明了胚胎具有显著的自我校正能力^{［45, 46］}。Orvieto等^［47］使用实时观测系统（TLM）发现多达64.0%的囊胚可排出细胞碎片。对每个囊胚及其相关的细胞碎片进行全基因组扩增（WGA）分析，发现63.6%的囊胚排出染色体重排异常的细胞碎片，其中9个整倍体囊胚中有5个（55.5%）排出非整倍体细胞碎片，进一步支持了这一观点。Magli等^［48］也发现TE结果为整倍体的囊胚的BF cfDNA扩增失败率高于非整倍体囊胚，表明这种自我校正机制可能使非整倍体囊胚具有更高的cfDNA浓度。而Kuznyetsov等^［40］则发现cfDNA的扩增量、片段的平均大小及与TE活检之间的一致率在高质量囊胚和中/低质量囊胚间均差异无统计学意义，且不同形态评级的囊胚的cfDNA扩增量和片段大小［（739.5±22.7）bp］相似。细胞凋亡可释放出核小体大小的DNA片段（180~200 bp），而坏死则导致更多的随机碎片和更大的DNA片段。该研究表明ICM和TE释放cfDNA的机制可能不仅仅是凋亡和坏死。

值得注意的是，越来越多的证据表明，由颗粒细胞、精子和极体引起的亲代污染可能存在于大多数的SCM样本中^{［20，33，42］}。最近Chen等^［49］对cfDNA进行了全基因组DNA甲基化测序，发现其来源于囊胚、颗粒细胞和极体。有趣的是，外胚层和滋养外胚层样本的甲基化图谱不同。研究者对没有被颗粒细胞和极体污染的61份第6天的SCM样本进行分析，发现1/3的SCM样本（18/61）定位于TE，另2/3（43/61）定位于外胚层，表明cfDNA同时来源于ICM和TE。

总之，越来越多的研究结果支持SCM中的cfDNA为胚胎起源，且胚胎细胞的凋亡和坏死可能不是其产生的唯一机制。因此，需要进一步地研究来确定cfDNA的产生机制，以及影响其分泌的过程和因素，它是利用cfDNA对胚胎进行遗传学检测，并获得可靠结果的前提。

niPGT有很多优点，如方法简单、避免胚胎活检损伤、降低成本等。然而，最近有研究发现，在不改变IVF实验室日常操作流程的情况下进行无创胚胎植入前非整倍体筛查（niPGT-A），并不能提供精确的诊断^［50］。因此，将niPGT应用到临床，操作流程的显著异质性也值得探究。

1.不同的胚胎培养方案：大多数niPGT的研究以小体积液滴培养胚胎来增加cfDNA的浓度。小体积培养似乎并不影响囊胚形成率^［51］，序贯或一体化培养液体系也不会影响结果^［52］。大规模的临床试验对不同种类的培养基和培养箱进行了比较，发现其对cfDNA结果的准确性没有显著影响^［25］。培养基中的白蛋白比例也不会干扰基于SCM的结果诊断^［53］。这些发现支持了cfDNA分析在特定操作流程下对每个IVF实验室的潜在适用性。

关于配子授精方式，大多数以卵胞质内单精子注射（ICSI）为主（占86.7%）^［54］，但一项多中心的研究（ICSI周期占90.6%）显示ICSI和常规IVF提供了相似的敏感性（87.9%比80.9%）和特异性（69.9%比78.6%）^［25］。Xie等^［32］研究也得出了类似结果，并发现来自常规IVF受精的cfDNA和相应囊胚的TE活检之间表现出很高的一致率（75%），且IVF和ICSI在整倍体胚胎的比例方面差异无统计学意义（P=0.553）。常规IVF受精与男性来源的精子污染的增加也无关^［25］。这是因为精子DNA需要在较强的裂解条件下才能实现扩增，而WGA裂解条件较为温和，可以在不扩增精子DNA的情况下有效扩增活检细胞或SCM中的cfDNA^［32］。因此，只要仔细去除卵母细胞或受精卵的颗粒细胞，ICSI和IVF都可以应用于niPGT。

关于SCM样本的收集时间，有研究发现培养至第6天收集的SCM样本比培养至第5天的SCM样本显示出更高的信息率和一致率^{［23, 24，26，49］}。将胚胎培养至第6天可增加SCM样本中胚胎DNA的浓度，减少来自母源的污染，并降低极体DNA的影响^［55］。延长胚胎培养至第6天的主要问题是其是否会影响胚胎的生存能力和生殖潜力。在一项多中心参与的niPGT-A研究中发现，培养至第6天的囊胚的妊娠率很高，与第5天或第6天玻璃化冷冻的PGT-A病例相当^［25］。

此外，大多数niPGT研究中的胚胎都进行了辅助孵化来增加DNA的释放，以确保SCM样本中有足够量的胚胎DNA^{［19, 20, 21, 22, 23，26，33，38，40］}。然而Hanson等^［28］则发现辅助孵化并不能促进胚胎DNA的释放，也不能提高结果的一致率。此外，Rubio等^［24］采用了一种完全无创的方案来进行niPGT，与TE活检的倍性一致率可高达84%。

2.降低外源DNA污染的方法：大多数研究者认为避免污染是niPGT研究中最大的挑战之一。污染主要来自母体残留的颗粒细胞和外部污染^{［24, 25，56］}。因此，必须在无菌条件下处理培养基，同时在更换培养基和将胚胎转移到培养液滴前进行额外的洗涤步骤。每个胚胎还应使用新的巴斯德管单独处理，来避免交叉污染。颗粒细胞与胚胎共培养时可通过增加细胞总数或基因表达水平来提高胚胎质量和促进囊胚发育^{［57, 58, 59］}。在IVF后或ICSI前的脱颗粒细胞过程只能去除绝大部分的颗粒细胞，这会大大增加实验室的工作量，并导致共培养环境的变化，从而影响胚胎的发育潜力。因此，Lei等^［31］在培养第3天对胚胎进行了再次脱颗粒细胞，不仅减少了工作量（有些胚胎可能已经发育阻滞），延长了共培养时间，还提高了cfDNA检测的准确性，与TE之间的倍性一致率接近70%。此外，该操作对囊胚形成、植入和持续妊娠率均没有显著影响。

3.扩增方法、测序平台或生物信息分析对结果的影响：常见的WGA方法有SurePlex、改良的基于多次退火环状循环扩增技术（MALBAC）和Reproseq。SCM样品中的cfDNA通常浓度较低、完整性差，这与分子方法的灵敏度低也有关，因此，已经开发了改良的WGA方案，来避免这种潜在的局限性^{［24, 25］}。此外，WGA过程中的初始细胞裂解/DNA提取步骤是不必要的，因为cfDNA分析即使不包括这一步骤也能提供良好的结果，同时还降低了母源污染的风险^［40］。早期的研究对MALBAC和Sureplex两种方法进行了比较，发现Sureplex更适合检测拷贝数的变化，而MALBAC因扩增的样本在基因组中的不均匀性可导致假阳性^［60］。另一方面，MALBAC对背景污染具有更高的敏感性^［61］。而关于niPGT的大多数研究都独立使用了这两种技术。最近一项使用新鲜胚胎的研究首次比较了Veriseq（Illumina^®）和NICS（Yikon^®）两种技术在SCM中的使用情况，分别采用SurePlex和MALBAC对样本进行WGA^［26］。结果显示了相似的诊断一致率（74.6%的SCM-NICS比72.3%的SCM-Veriseq）。差异分析表明，母源DNA污染和胚胎嵌合是限制niPGT-A结果准确性的主要因素，而不是染色体分析技术。

目前最常用的WGA产物的染色体分析方法有NGS和比较基因组杂交（CGH）。在一项使用TE活检细胞作为样本比较两种技术的研究中显示，与CGH相比，NGS在检测部分非整倍体、不平衡易位和嵌合体方面具有更高的稳健性、准确性和灵敏度^［62］。而对于NGS结果的分析，需要优化诊断规则和算法。不同研究调整了诊断染色体为非整倍体的临界值，以提高与TE活检或WB比较时的敏感性和/或特异性。不同胚胎样本之间的倍性一致率取决于所使用的嵌合报出阈值^［63］，因为适用于TE活检和SCM样本的标准也可能不同，因此，每个实验室必须设置适当的阈值来定义染色体异常。同时，对于复杂结果的分析应谨慎处理，因为它们更可能是受DNA降解和储存条件等因素的影响，而不是代表囊胚的真实遗传组成。

使用SCM样本进行cfDNA分析，并结合形态学评估，然后根据染色体情况确定囊胚移植顺序，可显著改善IVF的临床结局。Rubio等^［24］根据TE活检结果对46对具有PGT-A适应证（主要是高龄患者）的夫妇进行单囊胎移植（SET），并回顾性计算两种不同情况下的临床结局：TE与SCM均为整倍体，以及TE为整倍体而SCM为非整倍体。研究发现整倍体TE/整倍体SCM的持续妊娠率是整倍体TE/非整倍体SCM的3倍（分别为52.9%、16.7%），但由于样本量较小，没有统计学意义。当TE和SCM均为整倍体时，SET并没有流产的发生。还有几个研究小组仅基于SCM的niPGT-A结果，进行了整倍体囊胚移植，得到了良好的临床结果。在第一项试点研究中，作者对7例有PGT-A或PGT-SR指征的夫妇进行SET后，有5例成功妊娠和活产^［34］。在第二项研究中，作者基于SCM结果对复发性自然流产或反复种植失败的患者移植了52个整倍体囊胚，临床妊娠率为58%，出生了27名健康婴儿^［64］。Franco等^［65］在预后良好的患者（<38岁）中也描述了类似的结果，持续妊娠率与PGT-A患者（61.5%）相当，高于常规的IVF或ICSI患者（48.5%）。最近，研究者以IVF作为主要授精方式，发现niPGT-A结合time-lapse的形态动力学参数，可用于确定胚胎优先移植的顺序，增加无创选择整倍体胚胎的概率^［50］。Xie等^［32］也证实了应用IVF作为授精方式的niPGT的可行性，特别是对于因非男性因素而接受PGT治疗的患者，联合IVF和niPGT有望成为一种新的策略。

关于TE结果为嵌合体的囊胚也进行了研究，Li等^［63］将这些囊胚进行再培养，发现当嵌合阈值设为50%时，niPGT-A与WB的一致率为87.2%，高于TE活检的一致率，提示niPGT-A能更准确地诊断嵌合体囊胚的倍性状态。Chen等^［41］也得出了类似的结论，niPGT-A在预测嵌合体胚胎的ICM核型方面可能比TE活检更可靠。

niPGT-A的诊断可行性不仅适用于已知的嵌合体囊胚，也适用于TE活检没有扩增结果的囊胚。有研究比较了niPGT-A在不同形态评级囊胚中与WB的非整倍性和性别一致性，发现高质量囊胚组与中低质量囊胚组之间的一致率差异无统计学意义（P=0.804），分别为62.5%和54.5%。在性别鉴定中，两组都观察到较高的一致率，这可能有助于诊断X连锁孟德尔病^［66］。该研究为niPGT-A作为一种非整倍体鉴定和性别鉴定的方法提供了可能性，特别是对低质量胚胎。Sun等^［67］还研究了NICS在正常染色体组和染色体重排组中的准确性，通过比较TE活检和NICS的检测结果，发现染色体正常组和染色体重排组在倍性一致率（73.1%比78.1%）、敏感性（94.9%比93.3%）、特异性（51.4%比53.3%）、阳性预测值（75.7%比66.3%）、阴性预测值（86.4%比89%）方面，两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

虽然已经对niPGT-A进行了一些探索，但目前关于无创胚胎植入前单基因遗传学检测（niPGT-M）的研究数据很有限，分析样本包括BF和SCM。少数BF样本的研究通过直接使用定量PCR（qPCR）来扩增17号染色体和Y染色体上的多拷贝基因或通过结合检测特定基因变异及其周围的多个SNPs^{［68, 69］}。尽管针对多拷贝基因进行扩增可能会潜在地提高DNA检测的敏感性，但这并不适用于单拷贝基因引发的疾病的检测。为了增强模板拷贝数用于后续的单个位点或染色体拷贝数分析，有些研究在WGA之后，再采用PCR扩增所选基因的特定区域（TCIRG1、SCN5A、RHO、EXTL1、SLC4A1、VWF、HSF4、NPC1、PTCH1、EPS8L3、SMN1、SRY、ACTB、PAH），并通过测序进行验证^{［69, 70, 71］}。这些研究证明了在BF样本中检测cfDNA的可能性，但也强调了相关的局限性，如WGA之后的低检出率（42.9%~84.0%），等位基因缺失增加，母源污染风险，缺乏一致性和可靠性等。对未经WGA的SCM样本的直接评估主要是通过采用qPCR的方法来用于性别鉴定，扩增基因包括SRY或TSPY1，并将Alu重复序列或多拷贝基因TBC1D3作为对照^{［69，72, 73］}。还有研究通过巢式qPCR来确定导致α-地中海贫血的缺失突变的携带者状态^［74］。SCM样本的分析还包括经WGA后，通过PCR和测序对MTHFR rs1801133多态性、HBB致病变异（β-地中海贫血症）（Sanger测序）和相关SNPs（NGS）进行基因分型^{［69，75, 76］}。上述研究都强调了母源污染会干扰SCM分析，并且发现培养第5天的样本可以提高诊断有效性。有趣的是，Esmaeili等^［77］基于SCM样本中SRY DNA和RNA的存在（GAPDH作为阳性对照），使用PCR和逆转录PCR进行性别鉴定，发现评估RNA可使niPGT-M中的污染问题最小化，因此可能比检测DNA更可靠。总之，niPGT-M中的母源污染和与活检细胞的低一致性仍然是未解决的问题，需要进一步的研究来评估临床应用的可行性。