2021年4月国家卫生健康委员会颁布了卫生行业标准WS/T 779-2021《儿童血细胞分析参考区间》，该标准是基于直接抽样方法，多中心筛选大样本28 d~18岁健康儿童青少年，在严格质量控制条件下，同时获得静脉血与末梢血的血细胞分析数据，按照不同年龄、不同性别制定了参考区间。该标准反映了儿童青少年血细胞参数的年龄依赖趋势，有助于儿童血细胞分析结果的精准解读。为了促进该标准的推广应用，本文对参考区间的建立及验证、参考区间应用常见问题的分析及处理建议等重点条款进行解读，以帮助儿科临床及检验工作人员更好地理解和应用本标准，为儿童健康评估、疾病诊断和治疗效果评估提供循证决策依据。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
经全国继续医学教育委员会批准，本刊开设继教专栏，文后附5道单选题，读者阅读后可扫描标签二维码答题，每篇可免费获得Ⅱ类继教学分0.5分，全年最多可获5分
成人血细胞分析参考区间不适用于儿童［1］，但由于儿童血细胞分析数值存在年龄依赖趋势，导致针对不同年龄阶段儿童筛选健康参考个体时，需要考虑不同年龄阶段儿童疾病谱对血细胞分析结果的影响；再加上低龄儿童血标本采集面临的挑战，导致我国一直未建立儿童血细胞分析参考区间。本项目组在国家卫健委法规司委托下，参考我国《临床实验室检验项目参考区间制定》［2］与美国参考区间建立及验证指南［3］，并借鉴我国成人团队建立参考区间的经验，在我国东北、华北、西北、西南、华中、华南、华东7大区域，覆盖22个省（直辖市或自治区）完成健康儿童抽样、招募及健康筛查，建立了28 d~18岁健康儿童静脉血和末梢血血细胞分析18项指标的参考区间，并招募7 557例儿童进行了验证。在进一步征求临床、检验、流行病学与统计学专家的意见后，制定了卫生行业标准WS/T 779-2021《儿童血细胞分析参考区间》（后文简称《标准》）［4］。为了完善医疗卫生机构实验室对儿童血细胞分析检验结果的报告和解释，本文对参考区间的建立及验证、参考区间应用常见问题的分析及处理建议等重点条款进行解读，旨在帮助儿科临床及检验工作者更好地理解和应用该标准。
参考个体筛选相关的抽样方法、筛选标准及流程详见标准条款A.2。
静脉血采集与处理按照 WS/T 661 ［5］及儿科临床标本采集有关要求执行；末梢血采集与处理按照《中国末梢采血操作共识》执行［6］。
1.参考个体准备（条款a）：全血细胞分析检测无禁食要求。要避免运动影响、尽量避免情绪激动、避免药物影响和不良生活习惯（熬夜）等影响。采血时操作者语言温和、动作轻柔，以安抚受试者，使其保持情绪稳定。
2.采血（条款c）：（1）静脉血：4个月以内的婴儿行颈外静脉或头皮浅静脉采血，3岁以上的儿童多行肘正中静脉或贵要静脉穿刺，其他年龄段儿童可根据实际情况进行选择；采用规格为21 G一次性蝶翼针和含乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝剂采血管；通过真空采血方式采集静脉血并混匀样本［5］。（2）末梢血：28 d及以上的参考个体，一般选择左手无名指的尺侧作为穿刺部位，穿刺部位要求无感染、血供良好。用75%乙醇进行皮肤消毒后，采用规格为21 G一次性安全型末梢采血器进行穿刺。在采集点的下方，轻柔、间歇性地对穿刺点周围组织施加压力以增加血流量，用无菌棉球或棉签拭去第一滴血，使用一次性微量采血吸管将血液转移至一次性末梢采血管内（含EDTA抗凝剂），封闭末梢采血管帽，采用上下颠倒或轻弹的方式进行末梢血混匀［6］。
根据前期项目组对样本保存与运送的预实验结果并考虑到大样本流行病学调查的可行性，样本采集后18~25 ℃保存，静脉血须在采集后8 h内完成检测，末梢血须在采集后4 h内完成检测。样本如需转运至实验室，应采用防水、防漏、结实的运送箱运输，途中避免振荡［6］。实验室需排除不合格标本（如采集量不足、肉眼观察有血凝块、显微镜下有血小板聚集）的影响，静脉血还应同时排除溶血、脂血和高胆红素的影响［7］。
按《医疗机构临床实验室管理办法》［8］及仪器说明书的要求制定所在实验室的血细胞分析检测程序并予以实施。
1.分析系统的选择（A.4.2）：项目组基于前期调研的结果，选择儿童医院血常规最常用的设备作为基线检测设备进行参考区间的建立。为了考察新建参考区间的适用性，参考区间的验证则未限制设备品牌和型号。项目组对目前国内临床常用4种血细胞分析系统进行了比对实验，其结果显示在儿童血细胞分析指标参考区间范围内，系统间的偏移均在可接受范围内，在保证分析质量的前提下，均可以使用本标准的参考区间［9］。
2.分析系统校准和性能验证（条款A.4.3）：项目组要求各分中心每年至少两次使用配套校准品对分析系统进行校准。按照WS/T 406的有关要求，对分析系统的本底计数、携带污染、精密度、线性、正确度、不同吸样模式的结果可比性及实验室内的结果可比性等进行验证，评价结果符合相关要求［10］。
3.血液样本检测及质量控制（条款A.4.4）：分析系统性能符合要求后方可进行血液样本检测，每份样本检测1次。室内质量控制采用高值、中值和低值3个水平配套质控品，室内质控应符合WS/T 406要求。项目组向各分中心发放血常规质量调查问卷，调查各分中心的性能验证及质量评估情况，并督促完善质量改进。各分中心每年至少两次参加国家卫生健康委临床检验中心组织的血细胞分析正确度验证、室间质量评价活动及技术培训和质量改进指导，以确保参与研究的各实验室数据的可靠性和一致性及研究结果的科学性［11］。
首先遵循美国临床和实验室标准协会（CLSI）EP28-A3c建议，采用Tukey法检查离群值；针对检测出的离群值，检索原始数据库进行溯源，分析离群值产生原因，如有明确原因时，将离群值排除，否则不予排除。数据清洗后，分别有12 487份静脉血和9 461份末梢血的血细胞分析结果用于建立儿童血细胞分析的参考区间［12］。采用嵌套方差分析，比较各个指标在不同地区间的差异，地区间差异没有实际临床意义时，重点考虑年龄、性别亚组划分。为了准确划分有临床意义的年龄亚组，项目组开发了儿童年龄亚组划分流程［13］，在满足年龄亚组组间变异大于个体间生物学变异的前提下［14］，针对年龄亚组划分的临床适用性征求临床专家意见。最后采用非参数法，计算参考值的下限（2.5%分位数）和上限（97.5%分位数）及其90%置信区间。结合临床意见对计算的参考限进行适当调整形成参考区间。
参考区间验证过程中研究对象的纳入与排除标准、流行病学调查流程及实验室分析的质量要求标准与参考区间建立相一致，验证数据来源于我国东北、华北、西北、西南、华中、华南、华东7个地区的22个省（自治区、直辖市）的22家儿童医院及综合医院儿科。最终入选参考区间验证的静脉血标本6 571份、末梢血标本4 995份。各中心的标本检测按照实验室的检测流程，使用日常检测仪器完成。按照参考区间建立时的性别、年龄亚组划分标准，将验证数据划分亚组后，将各地区的验证数据分别与相应亚组的参考下限与上限值进行比对。验证结果显示，儿童静脉血和末梢血的血细胞分析参考区间18项指标中，除了红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、血细胞比容（Hct）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）5项指标在高海拔地区（海拔在1 000 m以上）超出参考区间上限的比例>10%未通过验证外，其他13项指标的验证通过率（验证通过单位数/参加验证单位数）和验证数据符合率（通过验证样本数/参加验证样本数）均>95%，满足WS/T 402规定要求［2］。
针对验证合格的参考区间，征求临床、检验、流行病学和统计学专家的意见150余条，召开6次研讨会进一步征求意见，最终确立参考区间。
1. 参考区间引用建议：由于建立儿童参考区间的研究工作量和成本巨大，实施难度较高，临床实验室引用参考区间比自己建立参考区间更为现实、可行（条款5.1.1）。本标准发布的参考区间在24家分中心均已通过外部验证。白细胞（WBC）、RBC、Hb、Hct和血小板计数（PLT）检验结果可溯源至国际公认的参考方法，详见标准的附录 B 中表 B.1。
2. 参考区间验证要求：本标准按照WS/T 402有关规定进行了参考区间的评估和验证（条款5.2.1）。实验室在应用本参考区间前，应对分析前、中、后全过程的质量管理和目标应用人群进行评估，尤其应征求临床医生的评审意见。若有理由认为与参考区间研究的分析质量和参考人群有足够可比性，可直接使用本文件的参考区间（条款5.2.2）。若对分析质量和目标应用人群可比性不确定，或实验室管理体系要求，需对引用的参考区间进行验证。
3. 项目组推荐的验证方案：针对儿童参考区间分层细、验证样本量大的问题，项目组依据CLSI EP28-A3c为实验室提供简化的验证方案。CLSI EP28-A3c认为参考区间转化后，使用小样本进行验证，可根据健康样本获得的难易程度，不一定把每个分组都进行验证，可以选择部分分组进行验证（间隔1组进行验证）即可达到验证的目的［3］。因此，项目组推荐了简化验证方案，所需样本量计算方法见表1，供各实验室参考。
儿童血细胞分析参考区间简化验证方案的样本量需求（例）
儿童血细胞分析参考区间简化验证方案的样本量需求（例）
| 年龄 | 男 | 女 |
|---|---|---|
| 28 d~<6个月 | 10 | 10 |
| 1~<2岁 | 10 | 10 |
| 6~<12岁 | 10 | 10 |
| 13~<18岁 | 20 | 20 |
| 合计 | 50 | 50 |
注：共计需要100例进行验证，在同一分组内，性別、年龄最好能够平均分配
4. 参考区间未通过验证的处理方法（条款5.3）：未通过验证时，实验室应首先评价分析质量，可依据标准的“附录B”对分析质量具体要求查找不足［4］，包括检测系统的性能验证和校准是否通过，室内质量控制和室间质量评价是否符合要求等［15］。在分析系统性能稳定的基础上，尤其要对分析系统的正确度进行评估分析。若证实因分析系统检测质量问题导致验证未通过，则应改进分析系统的检测质量。分析质量评价可采用：分析可互通有证标准物质或其他适宜参考物质；参加适宜的正确度验证计划或标准化计划；与性能可靠的其他系统或方法进行比较等方式。改进分析质量后再次进行验证（条款5.3.1）。此外，未通过验证的情况还可能由于人群差异导致的，如民族不同，或者人群居住地差异，如来自高海拔地区（海拔在1 000 m以上），或人群有某种特殊生活习惯等，此情况下则应按WS/T 402要求建立或引用适宜的参考区间（条款5.3.3）［2］。
1.参考区间的临床适用性：本标准的适用性主要取决于实验室检验结果与参考区间建立时检验结果的可比性以及人群的适用性（条款5.1.2注1）。项目组在研究过程中考虑到了地域差异可能造成参考区间不适用的情况。验证结果显示：高海拔地区人群（海拔≥1 000 m）的Hb和RBC等指标明显高于其他地区，超出本参考区间的比例>10%，不适用本参考区间。成都与重庆两个地区的儿童血小板在8岁之前与其他地区差异无统计学意义，8岁之后呈现降低趋势，直到≥12岁，差异有统计学意义。因此本标准发布时，对以上指标的地区差异进行了相关说明（见5.3.3 b）［4］，建议实验室在使用本文件的参考区间前应进行必要的验证或评估，尤其是要考虑上述一些特殊地区的情况。
2. PLT参考限问题：临床反馈本标准制定的PLT下限过低。建议实验室按照全血细胞分析操作说明书执行血常规检测，避免末梢血采集后放置时间<5 min时造成PLT偏低。关于PLT上限偏高可能触及危急值这一问题，一方面本项目制定的PLT参考区间已通过扩大范围验证，并与多个国家的儿童PLT参考区间上限值呈现同样的分布趋势，但是，目前临床使用的儿童PLT危急值却无高质量证据支持，提示需要开展研究确定儿童PLT危急值［16］。此外，国际临床化学和实验室医学联合会（IFCC）推荐的成人PLT危急值为1 000×109/L［17］，该危急值与本标准参考区间的上限（最高值为653×109/L）有较大的差距。
3. 信息系统应用：正确应用儿童参考区间，要求实验室信息系统（LIS）应具备相应的参考区间维护功能。在实验室信息系统内维护参考区间上限和下限参数时，针对每个项目均需按照“标本类型+性别+年龄”进行设置，否则需要通过程序的改进来实现。在对标准中参考区间进行系统维护前需要制定详细维护计划，包括与临床沟通确认系统维护以及新参考区间启用时间，告知临床维护前后报告单变化的内容，并做好实验室内人员培训。在信息系统维护时，尽量选择患者相对较少时段，系统录入内容的内涵应与标准中参考区间的内容保持一致，尤其要关注年龄段的划分理解要准确。参考区间设置时需双人核对，避免信息录入错误。设置完成后需及时对检验报告单中参考区间内容进行验证，验证中注意覆盖全要素（标本类型+性别+年龄），确保不同标本类型、性别和年龄层次参考区间的正确引用［18］。
标准发布实施后仍需要定期进行修订和完善，欢迎广大读者反馈意见和建议，为将来标准的修订和完善提供参考依据。
宋文琪, 彭晓霞, 倪鑫. 卫生行业标准WS/T 779-2021《儿童血细胞分析参考区间》解读及应用[J]. 中华医学杂志, 2023, 103(27): 2124-2127. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20230328-00493.
所有作者声明不存在利益冲突
1.参考区间是指参考下限和参考上限之间的分布区域，通常是正常个体检测结果（）分布区间
A.80%
B.90%
C.95%
D.100%
2.影响儿童全血细胞分析参考区间应用，采集末梢血不正确的方法为（）
A.28 d及以上的参考个体一般选择左手无名指的尺侧作为穿刺部位
B.采集耳垂血标本
C.穿刺部位要求无感染、血供良好
D.在采集点的下方，轻柔、间歇性地对穿刺点周围组织施加压力以增加血流量
3.关于参考区间应用前的验证与评估，以下错误的是（）
A.按WS/T 402有关规定进行参考区间的评估和验证
B.实验室在验证和应用本标准参考区间时，其分析质量要满足基本要求
C.若实验室对分析质量和目标应用人群的可比性不确定，可以不进行参考区间进行验证
D.参考区间在应用前，应征求临床医生的评审意见
4.参考区间未通过验证的处理方法，以下错误的是（）
A.实验室首先要评价和改进分析质量
B.要考虑到高海拔地区人群的差异
C.要考虑到人群的地理分布、生活习惯等因素的差异（如血小板计数）
D.未通过验证实验室可以直接先用，以后再验证。
5.信息系统维护儿童全血细胞分析指标参考区间时，以下正确的设置是（）
A.标本类型+性别+年龄
B.仅维护性别
C.仅维护年龄
D.仅维护标本类型
