急性髓系白血病（AML）是一类骨髓原始幼稚细胞恶性增殖性疾病，白血病干细胞由于增殖失控、分化障碍和细胞凋亡受阻等原因，产生大量未成熟的异常髓系细胞堆积在骨髓和外周血中，导致骨髓正常造血功能受损和功能衰竭[1,2]。研究发现AML的发生与染色体异常、基因突变以及基因表达异常有关[3]。目前正常核型被认为是AML患者预后中等的一个标志，但由于患者往往可伴随不同突变且具有不同的克隆，而导致预后具有极大的异质性。RAS在AML中突变率约为30%，可参与多种肿瘤的形成与发展，与预后不良相关[4,5,6]。目前关于RAS突变正常核型AML（CN-AML）患者的临床特征、克隆特点及RAS突变对预后的影响仍有争议。本研究分析初诊CN-AML中RAS突变患者的临床特点及RAS突变对预后的影响。
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急性髓系白血病（AML）是一类骨髓原始幼稚细胞恶性增殖性疾病，白血病干细胞由于增殖失控、分化障碍和细胞凋亡受阻等原因，产生大量未成熟的异常髓系细胞堆积在骨髓和外周血中，导致骨髓正常造血功能受损和功能衰竭[1,2]。研究发现AML的发生与染色体异常、基因突变以及基因表达异常有关[3]。目前正常核型被认为是AML患者预后中等的一个标志，但由于患者往往可伴随不同突变且具有不同的克隆，而导致预后具有极大的异质性。RAS在AML中突变率约为30%，可参与多种肿瘤的形成与发展，与预后不良相关[4,5,6]。目前关于RAS突变正常核型AML（CN-AML）患者的临床特征、克隆特点及RAS突变对预后的影响仍有争议。本研究分析初诊CN-AML中RAS突变患者的临床特点及RAS突变对预后的影响。
回顾性分析2016年12月至2021年12月在山西医科大学第二医院中心诊治的148例初诊CN-AML患者，所有入组患者均完成骨髓细胞形态学、免疫分型、染色体核型、融合基因（MICM）分型检测，收集患者初诊时的年龄、性别、血常规、LDH、骨髓原始细胞比例、流式免疫分析、染色体核型、危险度分层及二代测序等资料。
参照文献[1]，所有患者接受蒽环类药物联合阿糖胞苷标准诱导化疗方案（"3+7"方案），诱导化疗达完全缓解（CR）后给予大剂量阿糖胞苷（3 g/m2每12 h 1次，共6次）3~4个疗程。61例患者在化疗期间联合地西他滨或阿扎胞苷进行巩固强化。20例患者接受异基因造血干细胞移植治疗。
应用二代测序方法对患者ASXL1、BOCR、BOCRL1、CALR、CBL、CSF3R、DNMT3A、ETV6、EZH2、FLT3、GATA2、IDH1/2、JAK2、KIT、KRAS、MLL、MPL、NOTHCH2、NPM1、NRAS、PDGFRA、PHF6、PIGA、RUNX1、SETBP1、SH2B3、SF3B1、SRSF2、TET2、TP53、U2AF1、WT1、ZRSR2等34种常见髓系相关基因突变进行检测。变异负荷（VAF）<5%不纳入分析。
参照Esther Onecha团队在评估AML中突变的主亚克隆判定方法以及根据二代测序结果推断AML中ASXL1、PTPN1等突变的克隆等级分类方法[2,7,8]，同时参考肖志坚教授团队[9]判定骨髓增殖性肿瘤中RAS突变主亚克隆的方式。我们以RAS突变的VAF≥10%其共突变基因，则认为RAS突变为主克隆；RAS突变的VAF<10%其共突变基因，则认为RAS突变为亚克隆。
所有患者采用查阅病历或电话的方式进行随访。随访截至2021年12月1日。CR：①临床无贫血、出血、感染及白血病细胞浸润表现；②HGB>90 g/L，白细胞计数正常或减低，分类无幼稚细胞，PLT>100×109/L；③原始细胞加早幼阶段细胞（或幼稚细胞）<5%，红细胞系统及巨核细胞系统正常。复发：血液或骨髓中的原始细胞再次>5%或在达CR后的任何髓外部位复发。总生存（OS）期：患者开始治疗至死亡或末次随访的时间。无复发生存（RFS）期：患者化疗达到CR后至疾病复发或因任何原因导致死亡的时间[1]。
采用SPSS 25.0软件进行分析，连续变量比较采用独立样本的Mann-Whtney U检验（不符合正态分布），分类变量比较采用Fisher精确概率法。生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，采用Cox比例风险模型进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。
根据二代测序结果，148例初诊CN-AML患者中，22例（14.9%）检出27个RAS突变，均为错义突变，且所有RAS突变位点均为热点突变。其中单纯NRAS突变16例，单纯KRAS突变3例，同时伴有NRAS与KRAS突变3例。RAS突变类型：NRAS突变以G12D（7/21）、G13D（6/21）位点为主，KRAS突变为G13D（2/6）与G12D（4/6）。RAS突变的中位VAF为22.7%（12.1%，38.4%），克隆等级分析显示亚克隆突变占54%，主克隆突变占46%（表1）。
22例伴RAS基因突变初诊正常核型急性髓系白血病（CN-AML）患者信息及RAS突变特征
22例伴RAS基因突变初诊正常核型急性髓系白血病（CN-AML）患者信息及RAS突变特征
| 编号 | 性别 | 年龄 | 危险度分层 | 基因 | DNA序列改变 | 蛋白质序列改变 | 突变类型 | 变异负荷（VAF） | 克隆等级 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 男 | 71 | 预后良好 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 38.4% | 主克隆 |
| 2 | 女 | 21 | 预后良好 | NRAS | G35T | G12V | 错义突变 | 42.8% | 主克隆 |
| 3 | 男 | 72 | 预后中等 | NRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 16.5% | 亚克隆 |
| 4 | 男 | 49 | 预后良好 | KRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 18.0% | 亚克隆 |
| 5 | 男 | 64 | 预后中等 | NRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 6.4% | 亚克隆 |
| 6 | 男 | 72 | 预后良好 | KRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 12.1% | 亚克隆 |
| 7 | 男 | 21 | 预后不良 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 8.9% | 亚克隆 |
| 8 | 男 | 21 | 预后不良 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 15.4% | 亚克隆 |
| NRAS | A182G | Q61R | 错义突变 | 7.8% | 亚克隆 | ||||
| KRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 9.0% | 亚克隆 | ||||
| 9 | 女 | 27 | 预后不良 | KRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 29.3% | 亚克隆 |
| 10 | 男 | 29 | 预后中等 | NRAS | A183T | Q61H | 错义突变 | 12.3% | 亚克隆 |
| NRAS | C181A | Q61K | 错义突变 | 12.0% | 亚克隆 | ||||
| 11 | 男 | 53 | 预后良好 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 35.4% | 亚克隆 |
| 12 | 男 | 63 | 预后中等 | NRAS | G34T | G12C | 错义突变 | 28.3% | 主克隆 |
| KRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 15.1% | 亚克隆 | ||||
| 13 | 男 | 36 | 预后良好 | NRAS | G34T | G12C | 错义突变 | 46.0% | 主克隆 |
| 14 | 男 | 29 | 预后中等 | NRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 41.6% | 主克隆 |
| 15 | 男 | 61 | 预后良好 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 22.7% | 主克隆 |
| 16 | 男 | 45 | 预后良好 | NRAS | G35C | G12A | 错义突变 | 8.0% | 亚克隆 |
| 17 | 男 | 64 | 预后良好 | NRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 44.4% | 主克隆 |
| 18 | 男 | 27 | 预后中等 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 25.0% | 亚克隆 |
| 19 | 男 | 29 | 预后中等 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 13.1% | 主克隆 |
| 20 | 男 | 58 | 预后中等 | NRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 44.4% | 主克隆 |
| 21 | 男 | 19 | 预后中等 | NRAS | G38A | G13D | 错义突变 | 44.4% | 主克隆 |
| KRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 32.0% | 亚克隆 | ||||
| 22 | 男 | 43 | 预后良好 | NRAS | G35A | G12D | 错义突变 | 30.0% | 亚克隆 |
RAS突变患者中男女各11例，中位年龄44（27，63）岁。实验室分析显示：RAS突变组中位WBC为28.37（10.44，262.69）×109/L，高于RAS未突变组（P＝0.014），中位单核细胞计数6.55（2.03，27.66）×109/L，也明显高于RAS未突变组（P＝0.003）。同时发现RAS突变组中位LDH（P＝0.004）以及α-羟丁酸脱氢酶（HBDH）（P＝0.012）亦均明显高于RAS未突变组。为进一步明确RAS突变患者骨髓原始细胞特征，对所有初诊CN-AML患者骨髓流式分析显示：RAS突变组骨髓原始细胞CD34表达阳性率显著低于RAS未突变组（36%对73%，Fisher，P＝0.001），其余差异均无统计学意义（表2）。
伴RAS基因突变的初诊正常核型急性髓系白血病（CN-AML）患者临床特征
伴RAS基因突变的初诊正常核型急性髓系白血病（CN-AML）患者临床特征
| 指标 | 总体 | RAS突变组 （22例） | RAS未突变组（126例） | 统计量 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 年龄[例（%）] | 0.054 | 0.816 | |||
| ≥60岁 | 44（30） | 7（32） | 37（29） | ||
| <60岁 | 104（70） | 15（68） | 89（71） | ||
| 性别[例（%）] | 0.043 | 0.837 | |||
| 男 | 77（52） | 11（50） | 66（52） | ||
| 女 | 71（48） | 11（50） | 60（28） | ||
| 实验室检查[M（Q1, Q3）] | |||||
| RBC（×1012/L） | 2.39（1.91, 3.11） | 2.7（2.14, 3.43） | 2.31（1.87, 3.05） | -1.195 | 0.232 |
| WBC（×109/L） | 11.48（3.08, 38.81） | 28.37（10.44, 262.69） | 8.71（2.71, 36.07） | -2.451 | 0.014 |
| PLT（×109/L） | 39（22, 76） | 40.5（24, 79） | 39（22, 73） | -0.462 | 0.664 |
| HGB（g/L） | 81（69, 101） | 89（76, 106） | 78（68, 100） | -1.414 | 0.157 |
| 单核细胞计数（×109/L） | 1.71（0.27, 11.47） | 6.55（2.03, 27.66） | 1.23（0.22, 7.59） | -2.991 | 0.003 |
| 骨髓原始细胞比例（%） | 58（35, 76） | 50（39, 66） | 62（33, 78） | -0.953 | 0.330 |
| LDH（U/ml） | 389（242, 589） | 550（381, 893） | 361（233, 547） | -2.892 | 0.004 |
| HBDH（U/ml） | 311（194, 483） | 413（291, 686） | 275（180, 446） | -2.526 | 0.012 |
| 危险度分层[例（%）] | 8.828 | 0.012 | |||
| 预后良好组 | 32（22） | 10（45） | 22（17） | ||
| 预后中等组 | 80（54） | 9（41） | 71（56） | ||
| 预后不良组 | 36（24） | 3（14） | 33（27） | ||
| 接受allo-HSCT | 20（14） | 1（5） | 19（15） | 0.991 | 0.319 |
注 HBDH ：α-羟丁酸脱氢酶；allo-HSCT：异基因造血干细胞移植
我们进一步分析伴RAS突变是否存在易伴随或互斥的突变基因，根据二代测序结果分析显示：RAS突变的CN-AML患者中，伴随NPM1、DNMT3A、TET2以及CEBPA突变频率分别为41%、32%、27%和18%。与RAS未突变组相比，RAS突变的患者更易伴随NPM1与DNMT3A突变。
在22例RAS突变患者中，RAS突变主克隆10例，亚克隆12例。其中2例RAS突变患者进行多次二代测序，结果显示，RAS突变无论是主克隆还是亚克隆，在化疗达CR时除胚系突变外所有突变变异负荷均明显降低或未检出。而在复发时，该克隆同时可能伴随有额外突变（如CEBPA等）且RAS及其伴随突变的变异负荷也明显增加（图1）。
RAS突变组与RAS未突变组患者完全缓解（CR）率分别为95%、82%，差异无统计学意义（Fisher，P＝0.371）；复发率分别为45%对26%，差异无统计学意义（Fisher，P＝0.078）；RAS突变患者OS相较于RAS未突变组差异无统计学意义（P＝0.084），但RAS突变组患者RFS时间明显缩短（P＝0.029）。由于RAS突变患者易伴随有NPM1、DNMT3A、TET2突变，我们进一步分析伴随突变是否对RAS突变的CN-AML患者的预后产生影响，结果如图2所示：在RAS突变的CN-AML患者中，RAS/NPM1双突变组患者的OS时间相较于RAS突变/NPM1未突变组患者差异无统计学意义（P＝0.186），但明显短于RAS未突变组（P＝0.008）。RAS/NPM1双突变组患者RFS（P＝0.024）明显低于RAS突变/NPM1未突变组与RAS未突变组（P<0.001）；同样，RAS突变的CN-AML患者在伴随DNMT3A（P＝0.005）或TET2突变（P＝0.007）时RFS时间明显缩短。10例主克隆与12例亚克隆两组患者在OS（P＝0.281）及RFS（P＝0.820）差异均无统计学意义。在148例患者中部分患者在治疗过程中可能联合地西他滨或阿扎胞苷，其中RAS突变且联合地西他滨或阿扎胞苷进行强化巩固12例，相较于标准治疗组，联合地西他滨或阿扎胞苷可明显延长患者OS时间（P＝0.003）与RFS时间（P＝0.007）。
基于上述分析发现，RAS突变对于患者RFS有显著影响，为明确RAS突变是否为影响预后的独立影响因素，我们将影响患者预后的因素纳入多因素分析，结果图3所示，RAS突变不是影响CN-AML患者OS（HR＝1.315，95%CI 0.587~2.943）与RFS（HR＝1.403，95%CI 0.501~3.929）预后不良的独立影响因素。
RAS基因编码的RAS蛋白经翻译后修饰可定位于细胞膜内侧，通过RAS/RAF/MEK和RAS/PI3K/AKT等信号通路传导细胞信号，调控细胞的增殖、分化和凋亡[10]。根据Knudson[11]的2次打击理论，AML发生包括两个遗传事件发生：Ⅰ类突变与Ⅱ类突变，其中I类突变介导增殖信号，Ⅱ类突变损害造血细胞分化，RAS突变属于Ⅰ类突变。虽然RAS基因包括KRAS、NRAS和HRAS三种，但HRAS突变占比小于1%且在血液疾病中检出率低，因此本研究对HRAS不予分析[4,12]。
目前大部分研究队列中包括异常核型患者中，RAS突变在初诊AML中发生频率为15%~20%，但对于RAS突变在CN-AML中的作用及预后仍不明确[4,5,6,13,14]。本研究中，我们通过对148例初诊CN-AML患者二代测序分析发现，RAS在CN-AML中突变检出率为15%，与AML总体一致。同时，RAS突变位点均以热点突变为主，其中G12D位点突变是主要类型，与国内外研究一致，表明RAS突变相对保守，研究发现，内源性NRAS G12D位点突变过度激活造血干细胞中的ERK1/2从而导致骨髓造血干/祖细胞扩增，并增强其自我更新能力，在抑制RAS或者MEK可明显使患者获益[15,16]。RAS突变的中位VAF值较低且以亚克隆为主，Akram等[17]研究亦支持此观点，提示RAS突变常为疾病发生晚阶段的分子事件，RAS通路的调控紊乱使AML细胞获得生长增殖优势，并在AML的发生发展中发挥关键作用。
在本次分析中发现，RAS突变组中位LDH以及HBDH均明显高于RAS未突变组，与国内外报道一致，表明RAS突变对于LDH、HBDH的表达可能存在调控关系，仍需后续进一步研究以证明其可能存在的内在联系。研究表明AML患者中NRAS突变易伴随NPM1突变，Padmakumar等[18]发现其二者共突变频率高，我们的分析结果也发现在CN-AML中有此现象。我们进一步分析NPM1与RAS共突变这个亚群，发现RAS的VAF均低于NPM1，且RAS突变以亚克隆为主，而NPM1突变却以主克隆为主。目前认为NPM1作为AML发生的早期分子事件并为预后良好的分子指标，但本次分析发现NPM1与RAS共突变患者RFS时间明显缩短，对此我们推测NPM1突变可能会利于RAS突变的发生并促进AML的发生发展。目前NPM1与RAS共突变预后不良的原因的机制研究报道较少，且对于RAS突变以亚克隆为主的现象目前也无法解释，NPM1突变是否会诱发RAS突变仍需进一步研究。在对2例患者RAS突变患者克隆演进分析时发现，在初次化疗时反应良好，化疗达CR时除胚系突变外所有突变变异负荷均明显降低或未检出。但在该克隆再次伴随有突变时复发。提示我们在达到CR时还应加强对突变基因的VAF检测，同时可能应使患者尽量达到更深层次的分子水平缓解，减少复发。
虽然目前对于RAS突变在AML中研究较多，但对于RAS突变的主亚克隆对预后的作用研究较少，我们进一步预后分析发现RAS主亚克隆间的预后差异无统计学意义，因本研究病例数较少，此观点我们仍需收集数据进一步分析，同时也期待更多研究团队的报道RAS不同克隆与预后的关系。我们的结果还表明RAS突变不是影响CN-AML患者独立的不良预后因素，与RAS在AML中不是独立的不良预后因素观点一致[17]。
本研究为单中心回顾性分析，限于病例数目，结论仍需多中心大样本前瞻性研究加以证实。
所有作者声明无利益冲突
