评价胶体金免疫层析、乳胶凝集试验、酶联免疫分析3种隐球菌荚膜抗原检测方法在隐球菌脑膜脑炎患者诊断和疗效评估中的价值。
采用上述3种方法对2012年10月至2015年3月在浙江大学附属邵逸夫医院住院确诊的57例颅内感染患者的脑脊液标本进行荚膜抗原检测，评估其对隐球菌脑膜脑炎的诊断价值；采用乳胶凝集试验、酶联免疫分析方法分别对10例患者脑脊液荚膜抗原进行动态监测，评估治疗期间脑脊液荚膜抗原水平与疗效的相关性。
胶体金免疫层析法和乳胶凝集试验对隐球菌脑膜脑炎诊断的敏感度均为95%，特异度均为100%；酶联免疫分析法诊断的敏感度及特异度均为100%；隐球菌脑膜脑炎患者脑脊液荚膜抗原水平随着患者疾病好转逐渐下降。
3种方法检测隐球菌荚膜抗原对隐球菌脑膜脑炎患者均具有重要诊断价值，其敏感度和特异度均在95%以上。胶体金免疫层析法适用于隐球菌脑膜脑炎患者的快速诊断；脑脊液隐球菌荚膜抗原水平的动态监测对其疗效观察有参考价值。
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隐球菌脑膜脑炎(隐脑)是最常见的真菌颅内感染。随着糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用及艾滋病的流行，其患病率逐年上升[1]。我国隐脑的诊治水平近年来已经有了快速提升，但仍存在不少漏诊误诊的情况，影响隐脑疗效。目前临床上采用脑脊液涂片墨汁染色、真菌培养及隐球菌多糖荚膜抗原检测等方法进行确诊。真菌培养和鉴定一般需要3 d，培养的阳性率为55%～80%[2,3]。墨汁染色操作简单，用时短，但灵敏度仅50%～80%[4]。隐球菌荚膜多糖抗原的检测，根据现有文献报道，具有高达90%以上的敏感度及特异度[5,6]，已经作为隐脑确诊的依据。本研究主要评价3种荚膜抗原检测方法(胶体金免疫层析、乳胶凝集试验和酶联免疫分析)在隐脑患者诊断中的价值，同时评估脑脊液荚膜抗原水平变化能否作为隐脑患者疗效及预后的重要指标。
选取2012年10月至2015年3月在浙江大学附属邵逸夫医院住院确诊的57例颅内感染患者，其中隐脑患者20例(经脑脊液培养或墨汁染色确诊)；非隐脑患者(结核性脑膜炎、化脓性脑膜炎、病毒性脑膜炎经治疗和随访证实)37例作为对照，在入院时留取上述57例患者脑脊液标本；同时留取10例在我院住院和随访的隐脑患者系列脑脊液(每4周留取1份脑脊液标本)，离心处理后保存于–80 ℃冰箱。共获脑脊液标本151份：隐脑患者114份，非隐脑患者37份。本研究获得医院伦理委员的批准和患者(或家属)知情同意。
隐球菌荚膜多糖定量检测酶联免疫层析法(ELISA法)试剂盒，由丹娜(天津)生物科技有限公司提供；胶体金免疫层析法试纸条(CrAg Lateral Flow Assay)及隐球菌抗原测定乳胶凝集法试剂盒(Latex–Cryptococcus Antigen Detection System)为美国Immuno–Mycologics，Inc公司产品，已由美国食品药品监督管理局(FDA)批准。
将1滴样本稀释液加入到无菌试管中，取40 μl脑脊液样本混合，将隐球菌抗原检测试纸条的白端没入样本液中，10 min后读取结果。出现两个条带(检测条带和对照条带)为阳性；仅出现对照条带为阴性；若对照条带未出现，说明检测无效应重新检测。
用标本稀释液倍比稀释脑脊液，取倍比稀释后的脑脊液样本100 μl，100 ℃孵浴5 min后，分别取25 μl于反应板上，加乳胶试剂25 μl，室温匀速5 min摇匀观察结果。结果判读：(–)无颗粒，均匀的乳浊液；(＋)细小颗粒，乳白色背景；(＋＋)小凝块，云雾状不均匀背景；(＋＋＋)小及大凝块，背景悬浮液；(＋＋＋＋)大的絮状凝块，背景清晰。参照乳胶凝集法试剂盒要求，取≥(＋＋)的结果为阳性结果，效价值为此时的稀释倍数。质控：阳性质控品效价≥(＋＋)，阴性对照效价≤(＋)，其中一项不符，重新检测。
配制工作洗涤液；取待测脑脊液标本、标准曲线组样本各300 μl，分别加入100 μl样本处理液混匀，放入水浴锅100 ℃加热3 min后，4 ℃，10 000 g离心10 min；分别取60 μl加入混合板孔，再加入酶标抗体60 μl混合，封板，37 ℃下孵育30 min；然后每孔转移100 μl至酶标板孔，设空白对照1孔，加入样本稀释液100 μl，封板，37 ℃下孵育30 min；揭开封板膜，洗涤酶标板，每孔每次加入不少于300 μl的洗液，洗涤5次，再每孔加底物溶液100 μl，37 ℃避光孵育15 min后每孔加50 μl终止液，加样顺序与加底物顺序相同，混匀后在450 nm处读吸光度(A)值。各孔A值减去空白对照A值后分析。以荚膜多糖浓度为横坐标，A值为纵坐标，作Logistic回归分析得到标准曲线方程，计算样本中荚膜抗原浓度。
20例隐脑患者脑脊液标本，胶体金法和乳胶凝集试验检测阳性19例，阴性1例(该患者外院治疗2个月后转至我院)；酶联免疫分析法检测20例均阳性；37例非隐脑患者3种检测方法检测均为阴性。胶体金法和乳胶凝集试验的敏感度为95%，特异度为100%；阳性预测值为100%，阴性预测值为97.4%。酶联免疫分析法的敏感性及特异度为100%；阳性预测值及阴性预测值都为100%；有1例已经在外院治疗2个月的隐脑患者，入我院时脑脊液隐球菌荚膜抗原胶体金法和乳胶凝集试验检测阴性，酶联免疫分析法检测其抗原水平为200 μg/L，其余19例患者脑脊液隐球菌荚膜抗原浓度均在600 μg/L以上。
按2010年美国感染性疾病协会(IDSA)隐球菌病治疗指南[7]对本院住院和随访的隐脑患者进行治疗。对本院初治的10例隐脑患者进行荚膜抗原半定量和定量检测。乳胶凝集试验半定量检测结果表明：随着治疗时间的延长，荚膜抗原滴度总体逐渐下降(图1)。10例初治隐脑患者治疗前脑脊液荚膜抗原滴度分布在1∶128～1∶65 536，诱导期治疗结束时抗原滴度分布在1∶4～1∶16 384。ELISA法进行荚膜抗原定量动态检测发现：荚膜抗原原浓度总体也呈下降趋势，与半定量检测结果类似(图2)。治疗前脑脊液荚膜抗原浓度分布在(861～1 267)μg/L，诱导期治疗结束时荚膜抗原浓度分布在(135～1 216)μg/L。
脑脊液标本荚膜多糖抗原检测已被推荐为确诊隐脑的常用方法，其明显优于脑脊液涂片墨汁染色及脑脊液真菌培养[8]。本研究结果显示：胶体金免疫层析法和乳胶凝集试验的敏感度为95%，特异度为100%，酶联免疫分析法的敏感度及特异度均为100%。其敏感度明显优于脑脊液墨汁染色找隐球菌和脑脊液隐球菌培养结果[8]。尽管有研究认为胶体金免疫层析法结果具有比乳胶凝集试验和酶联免疫分析方法具有更高的可信度[9,10]，但本研究结果表明：3种方法检测结果的敏感度和特异度差异无统计学意义。因此，通过上述3种方法对颅内感染患者脑脊液标本进行隐球菌荚膜抗原检测对隐脑患者的及时诊治，具有重要价值和临床应用前景，尤其是胶体金免疫层析法同时具有快速(10 min)、便捷、操作简单的特点，可以作为疑似隐脑患者诊断的常用方法。其中有1例在外院已经治疗2个月的隐脑患者胶体金免疫层析法和乳胶凝集试验检测阴性，酶联免疫分析方法测得其抗原水平为200 μg/L，可能是胶体金免疫层析法和乳胶凝集试验检测的敏感性不够。
10例在我院住院和随访的初治隐脑患者脑脊液荚膜定量随访结果显示：在治疗过程中随着隐脑患者临床症状的改善，脑脊液炎症指标的逐渐好转，其抗原水平也逐渐下降，乳胶凝集试验及酶联免疫分析法的检测结果与临床改善均具有较高的符合度。监测荚膜抗原水平有助于判定患者病情变化及药物的疗效，隐球菌荚膜抗原的随访检测对疗效观察有重要价值[11]。在诱导期治疗结束时，两种方法检测的抗原水平都有明显的下降。两种方法定量检测治疗前荚膜抗原水平最高的是同一患者，该患者起病时病情重，颅内压很高，在药物治疗的同时使用ommaya泵穿刺降颅压。随着治疗的进展，荚膜抗原水平逐渐下降。患者在治疗第13周拔除ommaya泵，在图3及图4中可见抗原水平都呈现轻度的反跳现象，可能存在少量隐球菌黏附于ommaya泵有关。该患者在治疗的28周其抗原检测转阴，第49周停药。是否可以根据抗原水平决定疗程，有待增加临床病例进行系统研究。由于本研究的病例数较少，多数还在治疗期，已完成疗程的只有1人，同时标本收集处理、实验操作等方面可能存在误差，对于乳胶凝集试验与酶联免疫分析法的优劣，荚膜抗原检测对疾病预后价值的评估以及抗原检测转阴后的停药节点等问题，还有待于进一步扩大临床病例进行深入研究。
