郝虎; 石聪聪; 吴鹰军; 王弘; 李思涛; 蔡尧; 董玛拉; 马艳梅; 肖昕

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.22.011

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• 论著 •

基于目的基因捕获的高通量测序技术在遗传代谢病诊断中的应用

中华实用儿科临床杂志, 2015,30(22) : 1721-1724. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.22.011

摘要

目的

探讨基于目的基因捕获的高通量测序技术对串联质谱联合气相色谱-质谱技术在遗传代谢病(IMD)诊断中的应用价值。

方法

收集中山大学附属第六医院遗传代谢病实验室通过串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测的疑似阳性10例患儿及其父母外周血样本，通过包含有153个常见的IMD致病基因捕获探针的高通量测序技术对患儿进行基因检测，采用Sanger测序技术对患儿阳性突变位点进行验证，并对其父母相应的位点进行检测。

结果

10例疑似IMD患儿，通过高通量测序技术确诊8例，包括全羧化酶合成酶缺陷症3例，甲基丙二酸血症mut型、甲基丙二酸血症cblB型、枫糖尿症Ⅰa型、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、Citrin缺陷症各1例。其中有1例经串联质谱联合气相色谱-质谱诊断为异戊酸血症的患儿，其基因检测发现1个错义突变(c.158G>C，p.R53P)和1个同义突变(c.732C>T，p.D244D)；另外1例疑诊为Citrin缺陷症的患儿，其基因检测发现1个错义突变(c.1156G>A，p.G386S)和1个同义突变(c.1194A>G，p.L398L)，这2例基因检测结果在理论上尚不能确诊。10例患儿中鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症患儿的致病突变属于自身新发生的基因突变，而其他患儿的致病突变均遗传于各自的父母。此外，高通量测序所检测的结果均经Sanger测序验证，二者结果全部一致。

结论

基于目的基因捕获的高通量测序技术在疑似IMD的检测中结果精确，不仅可为临床医师提供可靠的分子诊断依据，还能精准地进行疾病分型，有效地为后续临床治疗和遗传咨询提供依据。

引用本文: 郝虎, 石聪聪, 吴鹰军, 等. 基于目的基因捕获的高通量测序技术在遗传代谢病诊断中的应用 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2015, 30(22) : 1721-1724. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.22.011.

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遗传代谢病(IMD)又称先天性代谢缺陷病，患儿出生时通常既无明显的表观异常，也无特异的临床表现，临床诊断困难^[1,2,3]。近年来，随着串联质谱、气相色谱-质谱技术应用的普及，越来越多的IMD患者得到早期诊断，但仍存在疾病分型不明确，部分缺乏有效治疗方法的现象^[4,5,6]。目前，基于目的基因捕获的高通量测序技术已应用于一些特定表型或某类疾病的筛查和诊断^{[7,8,9,10,11,12]}，该技术可在分子水平准确地进行疾病诊断与分型。本研究通过筛选常见的IMD(如甲基丙二酸血症、丙酸血症、枫糖尿病、酪氨酸血症、生物素酶缺乏症、全羧化酶合成酶缺乏症、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、戊二酸血症、β-酮硫解酶缺乏症、异戊酸血症等)相关153个致病基因制成捕获芯片，运用高通量测序对串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测的IMD疑似阳性患儿进行基因检测，以探讨该技术对IMD的诊断价值。

1　资料与方法

1.1　一般资料

收集2014年4月至2015年5月中山大学附属第六医院遗传代谢病实验室通过串联质谱联合气相色谱-质谱技术检测的10例IMD疑似阳性患儿及其父母的外周血样本。10例患儿均根据临床表现、体征、血斑串联质谱检查及尿液气相色谱-质谱检查结果做出临床诊断，其中3例生物素酶缺乏症或全羧化酶合成酶缺乏症、2例甲基丙二酸血症、2例半乳糖血症或Citrin缺陷病、1例异戊酸血症、1例枫糖尿症和1例鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症。本研究获得中山大学附属第六医院医学伦理委员会的批准，且受试患儿家属均知情同意。

1.2　基因组DNA提取

采集患儿及其父母静脉血2 mL，利用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(the QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen)提取基因组DNA，用Nanodrop 2000(Thermo公司，美国)超微量核酸蛋白测定仪对样本DNA进行质控。

1.3　DNA全基因组文库制备

分别取10例患儿的基因组DNA 3 μg,用1×low TE Buffer稀释到30 μg/L，采用Covaris S2超声仪进行超声片段化，纯化片段长度约为150 bp。用NEBNextDNA文库制备试剂盒(美国NEB公司)制备全基因组文库，产物通过PCR进行扩增后纯化。合格的文库样本于－20 ℃冰箱保存。

1.4　目标基因区域的捕获及高通量测序

利用GenCap基因序列捕获技术(北京迈基诺公司)将含有153个常见的IMD致病基因的捕获探针(北京迈基诺公司)和患儿的全基因组文库混合，其疾病相关基因片段被杂交至探针上，经洗脱处理将非目标区域的DNA片段洗掉，从而富集致病基因片段。利用Hiseq－2000(美国Illumina公司)测序仪按照Illumina标准操作步骤对富集文库进行高通量测序。

1.5　数据筛选及生物信息学分析

目标区域测序后经Trim-Galore程序过滤处理获得读数，保留读数质量>20和读取长度>80 bp的序列，运用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件与人基因组数据库(HG19)比对，再采用GATK软件包对点突变、插入突变或缺失突变等进行收集。

1.6　Sanger测序验证

依照常规的Sanger测序技术对高通量测序结果中的阳性突变位点进行验证，并运用该技术对患儿父母基因组DNA进行相应的阳性位点检测。

2　结果

2.1　临床资料

枫糖尿症1例患儿表现为特异性尿焦糖样气味，生物素酶缺乏症或全羧化酶合成酶缺乏症3例患儿均表现为顽固性皮疹，异戊酸血症1例患儿表现为特殊汗脚味。根据串联质谱及气相色谱-质谱检查结果，5例患儿得到明确诊断，另外5例无法辨别或进行分型诊断，见表1。

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表1

遗传代谢病10例患儿的临床表现、串联质谱及气相色谱-质谱检测结果

Table 1

The clinical presentation and detected results by tandem mass spectrometry and gas chromatography－mass spectrometry of 10 patients with inherited metabolic disease

表1

遗传代谢病10例患儿的临床表现、串联质谱及气相色谱-质谱检测结果

Table 1

The clinical presentation and detected results by tandem mass spectrometry and gas chromatography－mass spectrometry of 10 patients with inherited metabolic disease

例序	性别	年龄	临床表现	串联质谱	气相色谱-质谱	诊断
1	女	10个月	嗜睡、酸中毒、尿焦糖样气味	亮氨酸、缬氨酸↑	2羟基异戊酸、2羟基异己酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、3羟基丙酸、3羟基异戊酸↑	枫糖尿症
2	女	2个月	嗜睡、酸中毒、抽搐、昏迷、喂养困难	C3、C3/C0、C3/C2、C3/C16↑	甲基丙二酸、甲基枸橼酸、乳酸、酮体、3羟基丙酸↑	甲基丙二酸血症
3	女	17 d	酸中毒、抽搐	酪氨酸、C3、C3/C0、C3/C2、C3/C16↑；C0↓	甲基丙二酸、甲基枸橼酸、乳酸、3羟基丙酸↑	甲基丙二酸血症
4	男	10 d	高乳酸、高血氨、黄疸、抽搐	瓜氨酸↓；丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸↑	乳清酸、尿嘧啶、乳酸↑	鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症
5	男	4个月	黄疸、肝脾大、圆胖脸、凝血功能检查异常	组氨酸、蛋氨酸、色氨酸↑	半乳糖、半乳糖醇、半乳糖酸↑	半乳糖血症或Citrin缺陷病
6	男	1个月	黄疸、肝大	丙氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸↑	半乳糖↑	半乳糖血症或Citrin缺陷病
7	男	2岁	皮疹、口腔炎	C5-OH、C5-OH/C8、C5-OH/C0、C3↑	3羟基异戊酸、3甲基巴豆酰甘氨酸、3羟基丙酸、甲基枸橼酸↑	生物素酶缺乏症或全羧化酶合成酶缺乏症
8	男	7岁	皮疹、口角糜烂、脱发	C5-OH、C5-OH/C8、C5-OH/C0、C3↑	乳酸、酮体、3羟基丙酸、3羟基异戊酸、丙酰甘氨酸、3甲基巴豆酰甘氨酸和甲基枸橼酸↑	生物素酶缺乏症或全羧化酶合成酶缺乏症
9	女	8个月	皮疹、精神运动发育落后	C5-OH、C5-OH/C8、C5-OH/C0、C0、C3、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、鸟氨酸↑	乳酸、3羟基丙酸、酮体、3羟基异戊酸、3甲基巴豆酰甘氨酸、甲基枸橼酸↑	生物素酶缺乏症或全羧化酶合成酶缺乏症
10	男	12 d	抽搐、脱水、特殊汗脚味	C5、C4-OH、C5/C0、C5/C2、C5/C3↑；C0及多种酰基肉碱↓	异戊酰甘氨酸、3羟基异戊酸↑	异戊酸血症

注：↑表示浓度增高；↓表示浓度降低；C0：游离肉碱；C2：乙酰肉碱；C3：丙酰肉碱；C5：异戊酰基肉碱；C8：辛酰肉碱；C16：棕榈酰基肉碱；C4-OH：3-羟基丁酰肉碱；C5-OH：3-羟基异戊酰肉碱

Markers"↑"and"↓"are depicted the increased and decreased concentration；C0：free carnitine；C2：acetylcarnitine；C3：propionylcarnitine；C5：isovaleryl－/2－methylbutyrylcarnitine；C8：octanoylcarnitine；C16：palmitoylcarnitine；C4－OH：hydroxy butyrylcarnitine；C5－OH：hydroxy isovalerylcarnitin

2.2　基于目的基因捕获的高通量测序结果及患儿父母的Sanger测序结果

10例患儿的高通量测序结果及其父母的Sanger测序结果见表2。例1枫糖尿症致病基因中的BCKDHA基因发生2个杂合突变，生物学分析均提示有害，提示该患儿是枫糖尿症Ⅰa型。例2甲基丙二酸血症致病基因中的MUT基因发生4个杂合突变，生物学分析4个突变均提示有害，提示该患儿是甲基丙二酸血症mut型。例3甲基丙二酸血症致病基因中的MMAB基因发生2个杂合突变，生物学分析其均提示有害，提示该患儿是甲基丙二酸血症cblB型。例4鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症的致病基因OTC发生1个纯合突变，生物学分析其均提示有害。例5 Citrin缺陷症的致病基因SLC25A13发生2个杂合突变生物学分析其均为有害。例6 Citrin缺陷症的致病基因SLC25A13发生1个杂合突变和1个纯合突变，生物学分析其杂合突变为致病性突变，而另1个为同义突变，理论上不能确诊患儿患有Citrin缺陷症。例7和例9均在全羧化酶合成酶缺陷症的致病基因HLCS中发现相同的纯合突变c.1522C > T，生物学分析为致病性突变。例8全羧化酶合成酶缺陷症的致病基因HLCS发生1个纯合突变，生物学分析为致病性突变。例10异戊酸血症的致病基因IVD发生2个杂合突变，生物学分析c.158 G > C为致病性突变，而c.732 C > T为同义突变，理论上不能确诊患儿患有异戊酸血症。

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表2

遗传代谢病10例患儿基于目的基因捕获的高通量测序结果

Table 2

The results of 10 patients with inherited metabolic diseases detected by high through-put targeted exome sequencing

表2

遗传代谢病10例患儿基于目的基因捕获的高通量测序结果

Table 2

The results of 10 patients with inherited metabolic diseases detected by high through-put targeted exome sequencing

编号	基因	染色体	转录本	外显子	核苷酸改变	氨基酸改变	纯合/杂合	诊断
1	BCKDHA	Chr19	NM－000709	IVS6	c.647－1G>A^a	剪切位点	杂合	枫糖尿症Ⅰa型
	BCKDHA	Chr19	NM－000709	Exon4	c.392A>G^b	p.131Y>C	杂合
2	MUT	Chr6	NM－000255	IVS3	c.753＋1del G ins9^a	剪切位点	杂合	甲基丙二酸血症mut型
	MUT	Chr6	NM－000255	Exon6	c.1106G>A^b	P.R369H	杂合
	MUT	Chr6	NM－000255	Exon9	c.1595G>A^b	P.R532H	杂合
	MUT	Chr6	NM－000255	Exon12	c.2011A>G^b	P.I671V	杂合
3	MMAB	Chr12	NM－052845	Exon3	c.289_290 del G^b	p.G97V fs X120	杂合	甲基丙二酸血症cblB型
	MMAB	Chr12	NM－052845	Exon7	c.566G>A^a	p.C189Y	杂合
4	OTC	ChrX	NM－000531	Exon2	c.148 G >T	p.G50X	纯合	鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症
5	SLC25A13	Chr7	NM－014251	Exon6	c.493C>T^b	p.Q165X	杂合	Citrin缺陷症
	SLC25A13	Chr7	NM－014251	Exon9	c.851_854delGTAT^a	p.R284fs 286X	杂合
6	SLC25A13	Chr7	NM－014251	Exon11	c.1156G>A^b	p.G386S	杂合	不能确诊
	SLC25A13	Chr7	NM－014251	Exon12	c.1194A>G^ab	p.L398L	纯合
7	HLCS	Chr21	NM－000411	Exon11	c.1522C >T ^ab	p.R508W	纯合	全羧化酶合成酶缺陷症
8	HLCS	Chr21	NM－000411	Exon8	c.1088T >A ^ab	p.V363D	纯合	全羧化酶合成酶缺陷症
9	HLCS	Chr21	NM－000411	Exon11	c.1522C >T ^ab	p.R508W	纯合	全羧化酶合成酶缺陷症
10	IVD	Chr15	NM－002225	Exon2	c.158 G >C ^a	p.R53P	杂合	不能确诊
	IVD	Chr15	NM－002225	Exon7	c.732 C >T ^b	p.D244D	杂合

注：a：突变来自父源；b：突变来自母源

a：represented mutation from the male source；b：represented mutation from the female source

2.3　Sanger测序验证的结果

对于高通量测序发现的致病突变均采用Sanger测序技术进行验证，其结果与高通量测序结果均一致，以SLC25A13基因的缺失突变c.851_854delGTAT为例，见图1。

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图1

Sanger测序验证基于目的基因捕获的高通量测序结果(以缺失突变c.851_854delGTAT为例)

Figure 1

The high throughput targeted exome sequencing confirmed by Sanger sequencing(for the example of deletion mutation c．851_854delGTAT)

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注：A：基于目的基因捕获的高通量测序结果图　B：Sanger测序结果图

A：the figure of high throughput targeted exome sequencing；B：the figure of Sanger sequencing

图1

Sanger测序验证基于目的基因捕获的高通量测序结果(以缺失突变c.851_854delGTAT为例)

Figure 1

The high throughput targeted exome sequencing confirmed by Sanger sequencing(for the example of deletion mutation c．851_854delGTAT)

3　讨论

大部分IMD在新生儿期发病，通常发病急、进展快，且无特异性临床表现，临床诊断较为困难。串联质谱及气相色谱-质谱技术使得IMD患儿能够得到早期诊断和治疗，但是多数IMD仍无特效治疗方法。因此，IMD的预防如产前诊断及准确的分型治疗在临床中显得尤为重要，而这些需求均依赖于精准的分子诊断技术。Wang等^[13]通过高通量测序技术对杜氏和贝氏肌萎缩症进行全面的基因分析。刘旭霞等^[14]利用目标基因捕获测序技术鉴定肥厚型心肌病患儿致病突变。王珺等^[15]采用高通量测序技术对甲基丙二酸血症患儿进行基因诊断。研究结果均显示，基于目的基因捕获的高通量测序技术具有低成本、高通量、高敏感度的特点，可灵活设计并同时可对各种类型突变进行检测，适合用于IMD的筛查和诊断。

本结果发现，10例患儿中串联质谱联合气相色谱-质谱技术能确诊的只有5例，另5例因检测结果的相似性而无法辨别，且确诊的5例中甲基丙二酸血症和枫糖尿症均有多种分型也未能区分，表明虽然串联质谱联合气相色谱-质谱技术是目前IMD筛查常用的有效手段，但其具有一定的局限性。通过高通量测序，10例中有8例得到，确诊其中2例甲基丙二酸血症因致病基因不同，被准确分型为甲基丙二酸血症mut型和甲基丙二酸血症cblB型，1例枫糖尿症被准确分型为枫糖尿症Ⅰa型。本结果表明，高通量测序技术较串联质谱联合气相色谱-质谱技术具有更高更精确的阳性诊断率。

例6经串联质谱联合气相色谱-质谱技术被诊断为半乳糖血症或Citrin缺陷病，但通过高通量测序，未发现半乳糖血症相关基因发生致病突变，仅在Citrin缺陷病的致病基因SCL25A13上发现1个错义突变(c.1156G>A，p.G386S)和1个同义突变(c.1194A>G，p.L398L)，分别为杂合突变和纯合突变，c.1156G>A突变被分析为有害，而c.1194A>G突变被分析为无害，该患儿理论上不能被确诊为Citrin缺陷病。病例10经串联质谱联合气相色谱-质谱技术被诊断为异戊酸血症，其基因检测发现1个错义突变(c.158G>C，p.R53P)和1个同义突变(c.732C>T，p.D244D)，这2个突变均为杂合突变，c.158G>C突变为有害，而c.732C>T突变为无害，该患儿理论上不能被确诊为异戊酸血症。串联质谱联合气相色谱-质谱技术的检测结果与高通量测序结果不一致，考虑其原因可能是串联质谱与气相色谱-质谱检测因药物、饮食或其他疾病等影响而存在一定的假阳性，也可能是导致发病的致病基因不在本研究所纳入的153种基因的范围中。

综上所述，基于目的基因捕获的高通量测序技术可以快速、精准检测出常见IMD的基因突变，不但为患者提供准确的基因诊断结果，而且还可以为临床医生在疾病分型诊断、药物治疗及后续的遗传咨询、产前诊断等提供有效的依据。

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贡献者信息

郝虎

510655　广州，中山大学附属第六医院新生儿科

石聪聪

遗传代谢病实验室

吴鹰军

广州医科大学附属第四医院检验科

王弘

广州市天河区妇幼保健院儿科

李思涛

510655　广州，中山大学附属第六医院新生儿科

蔡尧

510655　广州，中山大学附属第六医院新生儿科

董玛拉

510655　广州，中山大学附属第六医院新生儿科

马艳梅

遗传代谢病实验室

肖昕

510655　广州，中山大学附属第六医院新生儿科

通信作者

肖昕

510655　广州，中山大学附属第六医院新生儿科

Email：txiaoxin1049@163.com

关键词

高通量测序; 遗传代谢病; 串联质谱; 气相色谱-质谱;

基金项目

广东省科技计划项目（2014A020212133）

广东省天河区科技计划项目（2013KW038）

历史

出版日期：2015-11-20

收稿日期：2015-09-10

本文编辑

周二强

Original Article

Application of high throughput targeted exome sequencing in the molecular diagnosis of inherited metabolic diseases

Hu Hao, Congcong Shi, Yingjun Wu, Hong Wang, Sitao Li, Yao Cai, Mala Dong, Yanmei Ma, Xin Xiao

Published 2015-11-20

Cite as Chin J Appl Clin Pediatr, 2015, 30(22): 1721-1724. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.22.011

Abstract

Objective

To evaluate the application value of high throughput targeted exome sequencing in inherited metabolic disorders(IMD) diagnosed by tandem mass spectrometry combined with gas chromatography-mass spectrometry.

Methods

Ten cases of peripheral blood were collected from the parents and children with suspected inborn errors of metabolism detected by tandem mass spectrometry combined with gas chromatography mass spectrometry in the testing center of the Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University.One hundred and fifty-three genes related to genetics metabolic disorders were analyzed to obtain the positive mutations utlizing the high throughput targeted exome sequencing technology.Then all the mutations were validated by Sanger sequencing, as well as their parents' corresponding sites.

Results

Eight of the 10 patients with suspected IMD were confirmed by high throughput sequencing targeted exome sequencing.Among the 8 patients, 1 patient with methylmalonic academia-mut type, 1 patient with methylmalonic academia-cblB type, 1 patient with maple syrup urine disease-Ⅰa type, 1 patient with ornithine carbamoyltransferase deficiency, 1 patient with citrin deficiency, and 3 patients with holocarboxylase synthetase deficiency.However, there were still 2 cases which could not be verified, 1 patient with the suspected isovaleric acidaemia diagnosed by gas chromatography-mass spectrome spectrometry who had a missense mutation c. 158G>C(p.R53P) and a same sense mutation c. 732C>T( p. D244D), the other one with citrin suspected deficiency had a missense mutation c. 1156G>A(p.G386S) and a same sense mutation c. 1194A>G(p.L398L). Moreover, the positive gene sites of the patient with ornithine carbamoyltransferase deficiency(X-linked recessive inheritance) mutated spontaneously which differed from the other 9 cases inherited from their own parents.Besides, all the data of high-throughput sequencing were confirmed by Sanger sequencing and in accordance with each other.

Conclusions

The use of high throughput targeted exome sequencing can make a precise diagnosis for patients with high risk of IMD.It can not only provide reliable molecular diagnosis, but also proceed accurate disease classification affording the basis for clinical and genetic conseling.

Key words:

High throughput targeted exome sequencing; Inherited metabolic disorder; Tandem mass spectrometry; Gas chromatography mass spectrometry

Contributor Information

Hu Hao

Department of Neonatology, the Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510655, China

Congcong Shi

Yingjun Wu

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