在CB6F1小鼠上建立黑色素瘤B16-F10细胞皮下移植瘤和肺转移瘤模型，为黑色素瘤的单倍体相合淋巴细胞输注的实验研究提供新的动物模型。
将B16-F10细胞株于CB6F1小鼠皮下及尾静脉注射接种，将小鼠按随机数字表法分成3组，即高剂量组(2×105细胞)、中剂量组(1×105细胞)、低剂量组(5×104细胞)，每组8只。筛选出最适接种细胞数后，分别建立皮下移植瘤和肺转移瘤模型，实验重复3次，观察成瘤率和荷瘤鼠的生存时间。
在皮下种植瘤模型中，高、中、低剂量组的小鼠成瘤分别为8、8、6只；在肺转移瘤模型中，高、中、低剂量组的小鼠肺转移瘤分别为8、8、5只。以1×105细胞接种建立的皮下移植瘤和肺转移瘤模型重复3次，每次5只小鼠均成瘤。
建立了一个成瘤率高、操作简单、稳定的小鼠黑色素瘤模型，为研究单倍体相合淋巴细胞输注提供理想的小鼠实体瘤模型。
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恶性黑色素瘤是由表皮基底部的黑色素细胞恶变而成，恶性度极高；主要组织相容性抗原复合物(MHC)单倍体相合淋巴细胞输注是异基因细胞免疫治疗的一种重要手段，在治疗黑色素瘤中具有一定的前景，其相应动物模型也在不断发展。其中子一代→子一代(F1→F1)模型能很好地解决临床应用中供者来源不足的问题[1,2]。本实验室所采用的单倍体相合F1→F1输注模型中，受者鼠为CB6F1小鼠(表型H-2b/d)，供者鼠为CC3HF1小鼠(表型H-2d/k)，因此，我们用来源于C57BL/6小鼠的黑色素瘤B16-F10细胞株在CB6F1小鼠建立肿瘤模型，以建立新的可供单倍体相合细胞输注研究的小鼠实体瘤模型，为进一步进行黑色素瘤的MHC单倍体相合供者淋巴细胞输注治疗的实验研究奠定基础。
C57BL/6小鼠来源的小鼠黑色素瘤B16-F10细胞株(表型H-2b)购自中国科学院细胞库(目录号：TCM36)。无特定病原体(SPF)级近交系CB6F1小鼠(BALB/c×C57BL/6，表型H-2d/b，♀)，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为SCXK(京)2012-0001，所有小鼠均饲养在福建医科大学实验动物中心SPF层流柜内[实验动物使用许可证号为SYXK(闽)2012-0001]。DMEM培养液、胎牛血清及胰酶(美国Gibco公司)。NAPCO-7000型CO2细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。
B16-F10细胞以DMEM全培养液(含10％胎牛血清，青霉素和链霉素各100 U/ml)，37 ℃、5 %CO2、饱和湿度环境常规培养、传代。
小鼠24只，按照随机数字表法随机分成3组，每组8只。用眼科剪小心剪去小鼠左后肢内侧鼠毛，用75％乙醇消毒小鼠此处皮肤，抽取上述B16-F10细胞悬液0.2 ml接种于小鼠左后肢内侧皮下，按B16-F10细胞不同接种数量定为高剂量组(2×105个细胞)、中剂量组(1×105个细胞)、低剂量组(5×104个细胞)，观察各组小鼠成瘤率。按得出的最适细胞数(成瘤率为100％时所用的最少细胞数)进行接种，每次接种5只小鼠，重复3次。观察并记录接种B16-F10细胞后小鼠的体质量、生存时间、成瘤时间、肿瘤大小等，种瘤后每2～3 d用游标卡尺测量肿瘤的短径和长径，并计算肿瘤体积。
肿瘤体积=肿瘤长径×短径2/2
小鼠24只，按照随机数字表法随机分成3组，每组8只。用75％乙醇消毒小鼠尾部皮肤，抽取0.3 ml B16-F10细胞悬液，于尾静脉注射到CB6F1小鼠体内，按B16-F10细胞不同接种数量将小鼠定为高剂量组(2×105个细胞)、中剂量组(1×105个细胞)、低剂量组(5×104个细胞)。于接种后第18天，脱颈处死各组小鼠，观察其肺部成瘤率。最后按得出的最适细胞数(成瘤率为100％时所用的最少细胞数)进行接种，每次接种5只小鼠，重复3次。观察接种肿瘤细胞后小鼠的体质量、生活、营养状态、生存时间的变化，小鼠全部处死后进行解剖学检查，称肺质量，计数肺结节数并行病理学观察。在解剖显微镜下分叶计数肺转移瘤灶的数目，转移灶为类圆形黑色小突起，呈结节状，部分转移灶可融合在一起，据肺结节直径将其分为四级：Ⅰ级≤0.5 mm，Ⅱ级>0.5 mm且≤1 mm，Ⅲ级>1 mm且≤2 mm，Ⅳ级>2 mm，计算肺表面转移结节总数。
肺表面转移结节总数=Ⅰ×1+Ⅱ×2+Ⅲ×3+Ⅳ×4
将小鼠麻醉后脱颈处死，解剖取出肿瘤及肺、肝、肠等组织，按照常规将组织制成石蜡切片，行苏木精-伊红(HE)染色后在光学显微镜下进行观察。
使用SPSS 19.0软件分析数据，计量资料用均数±标准差来表示，各组样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异具有统计学意义。
高、中、低剂量组的各8只小鼠成瘤分别为8、8、6只，低剂量组肿瘤出现时间最晚，小鼠肿瘤出现的时间随着接种细胞数量的减少而逐渐延长，由此得出最适细胞数为中剂量组接种的细胞数(1×105个细胞)。在随后的3次重复实验中，CB6F1小鼠皮下接种1× 105个B16-F10细胞后，第5天开始相继出现黑色的点或线状改变，肿瘤生长速度基本一致，渐发展为结节状改变，直至肿瘤破溃、出血、死亡，成瘤率为100 %(15/15)。随着肿瘤的增大，小鼠渐表现出活动度减少、弓背、呆滞、厌食、死亡等表现，全部小鼠死于肿瘤，无自发缓解。3次实验中，各组小鼠的肿瘤体积、生存时间基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)(图1、表1)。
黑色素瘤B16-F10细胞皮下种植荷瘤CB6F1小鼠生存时间(d)
黑色素瘤B16-F10细胞皮下种植荷瘤CB6F1小鼠生存时间(d)
| 实验顺序 | 只数 | 生存时间(范围) | 平均生存期( ±s) |
|---|---|---|---|
| 第1次 | 5 | 19～28 | 23.8±4.1 |
| 第2次 | 5 | 20～27 | 24.4±3.0 |
| 第3次 | 5 | 21～29 | 25.2±3.0 |
注：3组间生存期比较，F=0.216，P=0.809
第4、7、10、13、16、19、22天3组肿瘤体积间比较，F值分别为0.233、1.059、3.280、2.342、2.000、3.351、0.380，均P>0.05
高、中、低剂量组的各8只小鼠肺转移瘤成瘤分别为8、8、5只，小鼠的生存时间也随着接种细胞数量的减少而延长，由此得出最适细胞数为1×105个。在随后的3次实验中，CB6F1小鼠尾静脉注射1×105个B16-F10细胞后，第7天开始小鼠渐表现出活动度减少、弓背、竖毛、厌食、呆滞等表现，最早死亡时间出现在接种细胞后第18天，最迟为第25天，15只小鼠全部死亡。解剖发现肿瘤满布肺，肺成瘤率为100 %(15/15)。3次重复实验中，小鼠肺结节数、肺湿质量、小鼠的生存时间基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)(表2、表3)。
黑色素瘤B16-F10细胞肺转移荷瘤CB6F1小鼠肺湿质量和肺结节数(
±s)
黑色素瘤B16-F10细胞肺转移荷瘤CB6F1小鼠肺湿质量和肺结节数(±s)
| 实验顺序 | 只数 | 肺湿质量(g) | 肺结节数(个) |
|---|---|---|---|
| 第1次 | 5 | 0.422 0±0.039 6 | 90.4±2.0 |
| 第2次 | 5 | 0.412 0±0.030 3 | 90.0±3.4 |
| 第3次 | 5 | 0.428 0±0.034 9 | 90.2±3.0 |
| F值 | 0.264 | 0.024 | |
| P值 | 0.772 | 0.976 |
黑色素瘤B16-F10细胞肺转移荷瘤CB6F1小鼠生存时间(d)
黑色素瘤B16-F10细胞肺转移荷瘤CB6F1小鼠生存时间(d)
| 实验顺序 | 只数 | 死亡时间(范围) | 平均生存期( ±s) |
|---|---|---|---|
| 第1次 | 5 | 20～24 | 21.8±2.1 |
| 第2次 | 5 | 18～25 | 21.4±2.7 |
| 第3次 | 5 | 20～23 | 21.0±1.2 |
注：生存期3组间比较，F=0.185,P=0.834
CB6F1小鼠皮下种植瘤模型中的左后肢内侧皮下肿物以及肺转移瘤模型中的肺部结节病理学检查均证实为黑色素瘤(图2)，其中癌细胞呈圆形或椭圆形，大小不等，边界不清，间质内见少量淋巴细胞浸润，周围有丰富的新生毛细血管，有黑色素颗粒分泌，核多，胞质少，核异型性明显，形态不规则，染色加深，核膜明显，核仁有多个，极少数为单个，染色质深浅不一，较细腻，核分裂象增多；肿瘤细胞在肺组织内呈浸润性生长，血管周围分布较多，异型性明显。15只皮下种植瘤模型中，2只死亡小鼠的肺组织可见肿瘤细胞浸润，其他脏器未见转移瘤；肺转移瘤模型中，未发现癌组织转移到其他脏器。
2A：小鼠皮下种植瘤；2B：皮下肿瘤组织 HE ×200; 2C：小鼠肺转移瘤；2D：肺转移瘤组织 HE ×200
恶性黑色素瘤是一种常发生于皮肤、恶性程度极高的肿瘤，其发病率逐年升高，2011年全球诊断出约70 230例新发恶性黑色素瘤病例，约8 790例死于该病，其5年生存率低于10%，属于最难有效治疗的肿瘤之一[3]。当前被认可的黑色素瘤治疗包括化疗、生物免疫治疗、靶向治疗等，然而，长期化疗所造成的不良反应仍是大多数患者所不能承受的[4,5,6]。异基因免疫治疗在黑色素瘤患者的临床试验中已经显示出令人鼓舞的结果[7,8,9]。供者淋巴细胞输注(DLI)是异基因免疫治疗的一种重要手段，它对治疗黑色素瘤具有一定的前景。但是肿瘤微环境中存在着各种复杂多变的免疫抑制网络，限制了它的实际疗效，仍有待于研究者对其内在机制进行深入探讨。
建立理想的动物肿瘤模型是研究肿瘤发生、发展、转移及评价疗效的重要方式，为寻求有效的预防和治疗措施提供依据。单倍体相合细胞输注的动物实验研究在不断开展，但目前国内外相关的实验动物模型大多为亲代→子一代(Parent→F1)模型[10,11,12]，这些模型一般用于研究移植物抗白血病，可供单倍体相合输注研究用的实体瘤动物模型甚少。相比Parent→F1模型，F1→F1模型更接近临床应用，单倍体相合的供者可来源于父母、子女、同胞及堂兄妹等，解决了供者来源不足的问题。本研究中，所采用的小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10的MHC表型为H-2b，是高转移细胞系，它的肿瘤特性与人类黑色素细胞特性相似[13]；所选择的CB6F1小鼠的MHC表型为H-2d/b，可兼容H-2b。我们将B16-F10细胞株接种到CB6F1小鼠体内，成功地建立了新的、可供单倍体相合细胞F1→F1输注研究的小鼠实体瘤模型。
在异基因免疫治疗的研究中，多数研究者都采用了皮下种植瘤模型，操作简单、直观性好、肿瘤大小易于测量[14,15]。我们建立的皮下种植瘤模型的成瘤率为100%，移植瘤生长较局限，边界清楚，易于观察测量；病理学检查证实皮下肿物为黑色素瘤，比较3次重复实验的小鼠肿瘤生长速度及生存时间，差异无统计学意义(P>0.05)，证明该荷瘤鼠模型稳定性好、重复性强，为单倍体相合细胞输注治疗黑色素瘤的实验研究提供了可靠的动物皮下种植瘤模型。
肿瘤转移是晚期肿瘤患者死亡的主要原因，转移瘤模型是肿瘤研究的常用实验模型之一。黑色素瘤早期就可以发生肺部转移，因此，为更好地研究黑色素瘤的肺部转移机制，我们同时也建立了B16-F10细胞的肺转移瘤模型。将最适细胞数(1×105个)细胞种植于小鼠，成瘤率均为100 %，病理学检查证实荷瘤鼠肺组织中有黑色素瘤结节，肿瘤细胞在肺组织内呈浸润性生长，血管周围分布较多，异型性明显。比较3次重复试验的小鼠肺结节数、肺湿质量及生存时间，差异均无统计学意义(均P>0.05)，证明该模型是成立的。此肿瘤模型的建立，对研究单倍体相合细胞F1→F1输注治疗转移性黑色素瘤具有重要意义。
综上所述，本实验建立了皮下种植瘤模型和肺转移瘤小鼠模型，具有操作简单、成瘤率高、重复性强、稳定性高的特点，为进一步进行黑色素瘤的MHC单倍体相合供者淋巴细胞输注治疗的实验研究提供了新的理想的动物模型。
