造血干细胞移植(HSCT)已经成为恶性血液病的重要治疗手段。然而，移植后疾病复发可显著降低患者的长期生存率。修正的供者淋巴细胞输注(MDLI)，输注的是经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的外周造血干细胞，而非静止状态的淋巴细胞。该方法能够减少供者淋巴细胞输注(DLI)后相关的移植物抗宿主病(GVHD)及复杂性血细胞减少，同时保留或者增强移植物抗肿瘤效应(GVT)，因此MDLI已经广泛用于恶性血液病移植后复发的治疗。笔者拟就MDLI的作用机制、临床适应证、输注剂量、输注时机、间隔时间、疗效评估等进行综述。
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恶性血液病移植后复发已经成为造血干细胞移植(hematopoietic stem cells transplantation，HSCT)后的重要并发症，并可严重影响患者的长期生存率。化疗、二次移植、靶向治疗、细胞免疫治疗等均可用于恶性血液病移植后复发的治疗。近年来，供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion，DLI)通过移植物抗肿瘤作用(graft versus tumour，GVT)诱导和维持疾病的缓解，可用于治疗复发、预防复发、逆转嵌合、增强免疫重建、控制感染及免疫抑制等多个领域。然而，DLI后相关的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)严重影响患者预后，限制其临床应用。目前，采用T细胞去除，去CD8＋T细胞，选择调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，自然杀伤(natural killer，NK)细胞，间充质干细胞及单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSK-TK)自杀基因导入淋巴细胞等供者移植物细胞的修饰方法，试图有效分离GVT和GVHD，旨在GVHD效应最小的同时使GVT效应最大化。大量研究对移植后复发或高危患者输注经粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)动员的供者外周血造血干细胞，即采用修正的供者淋巴细胞输注(modified donor lymphocyte infusion，MDLI)代替静止状态的DLI，并且在MDLI后短期应用免疫抑制剂，可有效分离GVT和GVHD，显著降低GVHD发生率及病死率，同时有效保留或增强GVT效应，使移植后复发或高危患者得到长期缓解，改善其预后[1,2]。因此，MDLI可策略性推动中、晚期急性白血病、恶性血液病移植后复发的治疗。
MDLI是指G-CSF动员供者外周血，再采集供者外周血造血干细胞回输至受者体内，发挥免疫效应的一种过继性细胞免疫疗法。传统的DLI是采集未经动员的外周血淋巴细胞，含有核细胞约为2×108个，其中约50%为CD3＋细胞，此外还有B细胞，树突状细胞(dendritic cell，DC)等。而经G-CSF动员的外周血造血干细胞，不但可使CD3＋细胞数量可增加近3倍，同时对细胞因子的表达也有重要影响，如增加白细胞介素(interleukin，IL)-10，转化生长因子-β和α干扰素水平等。因此，MDLI中异基因T细胞能够显著发挥GVT效应，促进混合嵌合状态向完全嵌合状态转化，并逐渐代替受者造血细胞发挥造血功能和免疫重建功能。另外，经G-CSF动员后细胞因子水平的改变，可促进辅助性T细胞(helper T cell，Th)2的分化，增加了Ⅱ类细胞因子及Treg数量，有利于降低GVHD发生率。
MDLI过程中，通过释放IL-2、Ⅰ型干扰素等细胞因子激活单核-巨噬细胞、B细胞，并增强CD8＋ T细胞的杀伤功能，从而发挥GVT效应。而CD8＋ T细胞可通过识别抗原提呈细胞呈递的肿瘤特异性抗原或次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigens，mHA)而被激活，并释放穿孔素或颗粒酶或通过Fas/FasL途径直接杀伤肿瘤细胞。mHA在GVT和GVHD中均发挥重要作用。mHA具有组织分布特异性，部分mHA(如mHA-1、-2、-5和B细胞谱系限制性mHB-1)可特异性表达于造血细胞、淋巴细胞及髓系恶性造血细胞。因此，特异性识别mHA的供者T细胞能够通过抗原靶向作用杀伤白血病细胞或肿瘤细胞，发挥GVT效应并同时避免GVHD发生。另外，异源性NK细胞在遇到杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)独特而不相合的肿瘤细胞时，可发挥强大的细胞毒作用，从而促进GVT效应。NK细胞攻击受者的造血细胞，而对受者靶组织不具有杀伤作用，因此并不诱导GVHD发生。NK细胞还可以杀伤受者的DC，阻断T细胞介导的GVHD，同时也可杀伤受者淋巴细胞而有利于移植物的植活。
细胞因子在GVHD和GVT中也发挥着重要作用。Th1合成的γ干扰素，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)和IL-2、-3称为Ⅰ型细胞因子，而Th2合成的TNF-α、GM-CSF和IL-3～-6、-10、-13等，则称为Ⅱ型细胞因子。Fowler和Gress[3]认为Th1/细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，Tc)1及Tc1分泌的Ⅰ型细胞因子在诱发GVHD的同时，可增强GVT，而Th2/Tc2及Tc2分泌的Ⅱ型细胞因子，则主要发生减轻GVHD效应。因此，Th1与Th2的细胞比值及其动态平衡，在GVHD和GVT中扮演着重要角色。此外，输注G-CSF动员的外周造血干细胞可通过改变T细胞功能来减轻GVHD，其机制目前尚未完全阐明，可能为：①G-CSF动员的供者造血干细胞含有抑制效应细胞，包括单核细胞、自然抑制性细胞或抑制性因子(IL-10等)，从而抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌。②G-CSF选择性减少DC1，并下调CD28/B7共刺激分子，使T细胞呈无应答状态[4]。③G-CSF动员可以使供者的DC向DC2分化，DC2诱导初始T细胞向Th2分化，使其分泌的Ⅱ类细胞因子分泌增多，而减少Ⅰ类细胞因子的产生，并相应减轻GVHD。④G-CSF可以直接诱导T细胞向T2细胞分化。
近年来，MDLI在恶性血液病移植后复发的治疗效果已受到广泛肯定。迄今为止，该方法已经应用于慢性髓细胞白血病(chronic myeloid Leukemia，CML)，急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)，急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)，多发性骨髓瘤(multimyeloma，MM)，淋巴瘤，再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)，自身免疫性疾病及EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)等相关感染性疾病的治疗。最近，Yanagisawa等[5]通过对1例儿童急性T淋巴细胞白血病移植后中枢神经系统复发的患儿行鞘内MDLI[(104～106)个/kg]的研究结果显示，该方法对中枢神经系统白血病有一定的GVT效应，并且未观察到GVHD发生。因此，鞘内MDLI有望成为中枢神经系统白血病的重要治疗手段。
MDLI在不同疾病中缓解率的差别较为悬殊。其中，CML对MDLI的治疗反应最佳，缓解率可达60%～80%，其次是MM和淋巴瘤，而急性白血病和MDS疗效相对较差。Negrin[6]研究结果显示，MDLI对CML、淋巴瘤(低危组)治疗效果较好，对霍奇金淋巴瘤、ALL治疗效果较差，而对非霍奇金淋巴瘤、MM的疗效介于上述二类疾病之间。究其原因，这可能是由于肿瘤细胞的生长速度超过供者外周造血干细胞发挥的GVT效应，或与肿瘤细胞缺乏特异性抗原有关，同时，MDLI的疗效还受输注剂量、输注时机、间隔时间、供者、复发疾病状态等多种因素影响。因此，MDLI仅对于进展相对缓慢的肿瘤性疾病可达到预期疗效。国内研究结果显示，对高危恶性血液病患者预防性应用G-CSF动员的供者外周造血干细胞，较治疗性应用者预防疾病复发的效果更为显著，可改善高危患者的远期预后[1,2]。
传统的DLI起初采用单次大细胞量方案输注，但其GVHD发生率较高，而应用分次逐渐增量方案，则既可以产生GVT效应，还可相对降低GVHD发生率。2次应用分次逐渐增量方案治疗的间隔时间通常为4～12周，当患者无GVHD发生，也无血液学改变时，即可进行下一次治疗。MDLI无需采用分次逐渐大量方案，并且可显著降低GVHD发生率，同时激发GVT效应最大化，因此该方案适宜在临床推广应用。
目前，国内外普遍采用重组人G-CSF[剂量为5 μg/(kg·d)×5 d]动员供者外周血造血干细胞，在第4天或第5天采集供者外周血有核细胞。然而，MDLI的输注剂量、输注间隔时间受疾病种类、疾病状态、供者和受者自身因素等多因素影响，迄今尚无统一标准。国内研究结果显示，经G-CSF动员的供者外周血有核细胞和CD34＋细胞的中位细胞数分别为108个/kg和106个/kg，而对急性白血病移植后复发患者输注的有核细胞和CD34＋细胞的中位细胞数分别为4×108个/kg和2×106个/kg[2,4]。同样，Guo等[7,8]研究结果显示，"微移植"技术要求所采集的外周血有核细胞和CD34＋细胞中位细胞数分别维持在2.8×108个/kg和1.8×106个/kg。因此，MDLI的输注剂量仍需大量临床试验不断探索及评估疗效，以寻找最佳、安全、有效的输注剂量。
MDLI的输注时机对平衡GVHD和GVT效应发挥着重要作用。移植后过早行MDLI可能加重"细胞因子风暴"，从而增加GVHD的发生率和由此导致的患者病死率；而延迟进行MDLI，或者在完全嵌合体形成后行MDLI，则不能及时预防高危恶性血液病患者复发及有效发挥GVT效应。Huang等[4]研究结果显示，在移植后90 d行MDLI既能减轻HSCT后相关的GVHD，又可以避免长期使用免疫抑制剂对GVT的影响。然而，该输注时机对高危、移植后近期复发的恶性血液病患者疗效欠佳。研究结果显示，对于移植前高危恶性血液病患者可将MDLI的输注时间提前，甚至可提前至移植后第6周[4]。
近年来，研究者不断探索能够精准监测恶性血液病复发的指标，并期望将其作为外周造血干细胞输注时机的依据。其中，嵌合状态及微小残留病(minimal residual disease，MRD)监测是目前研究的热点。在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)中，造血嵌合体是指供者来源的造血细胞部分或完全植入受者体内，根据受者体内供者造血细胞所占比例可将其分为3种类型：完全嵌合，allo-HSCT后供者细胞占据受者的骨髓或外周血造血细胞比例≥97%；混合嵌合，allo-HSCT后受者标本中能同时检测到供者与受者细胞成分，其中供者细胞比例占2.5%～97%；微嵌合体，allo-HSCT后供者细胞占受者的骨髓或外周血细胞成分比例<2.5%。混合嵌合和完全嵌合可以出现在移植后的不同时期，并随病情的演化和时间的推移而变化[9]。嵌合状态的检测可通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和免疫荧光杂交、荧光磁珠等技术分析染色体上的可变串联重复序列或短串联重复序列来分析供、受者的嵌合状态。MDLI可促进混合嵌合向完全嵌合转化，使供者免疫细胞及造血干细胞发挥免疫重建功能，并促进受者造血恢复。因此，对于移植后嵌合状态由完全嵌合逐渐转化为混合嵌合或者混合嵌合比例逐渐下降的患者，应及时进行再次输注，预防或治疗疾病复发。同样，"微移植"技术可通过形成的微嵌合体诱导GVT，分离GVHD和GVT[10]。此外，Yan等[2]通过对移植后MRD＋患者行MDLI，发现可以改善移植后MRD＋高风险复发患者的预后。因此，通过流式细胞学或融合基因PCR定量检测MRD可用于监测疾病复发、选择输注时间及评估疗效。
如何提高MDLI的免疫应答、增强疗效是目前面临的重大问题。MDLI联合IL-2可以有效提高细胞毒性效应T细胞和NK细胞的活性，同时IL-2可选择性诱导CD4＋CD25＋叉头框蛋白(fork head box protein，Foxp)3 Treg的产生，发挥免疫耐受作用，抑制GVHD的发生。亦有研究结果显示，MDLI联合IL-2治疗恶性血液病可增加GVHD的发生率[11]。但是，该方法的可靠性仍有待进一步研究结果证实。此外，干扰素、IL-4等诸多细胞因子均能增加GVT。但是近年来，化疗联合MDLI已经成为allo-HSCT后复发的有效治疗方法，特别是对血液学复发患者疗效更佳。MDLI前的化疗有助于减轻肿瘤负荷，提高疗效。
陈玲珍等[12]研究结果显示，DLI联合化疗治疗allo-HSCT后血液学复发疗效显著，不良反应小，安全性高。Yan等[2,13]分别对AML及MDS移植后复发患者采用AA化疗方案(阿柔比星20 mg/d×7 d＋阿糖胞苷150 mg/m2×7 d)，而对ALL移植后复发患者采用甲氨蝶呤1 g/m2×1 d化疗方案，并于化疗后48～72 h输注经G-CSF动员的外周造血干细胞。而Guo等[7,8]对AML患者采用MA化疗方案(米托蒽醌8～12 mg/m2×3 d＋阿糖胞苷150 mg/m2×7 d)，对淋巴瘤采用Hyper-CVAD/MA化疗方案，同时联合MDLI(化疗后48～72 h)取得显著疗效。最近，Schroeder等[14]回顾性分析阿扎胞苷联合MDLI治疗白血病移植后复发患者，发现氮杂类联合MDLI对MDS、AML和低负荷移植后复发患者治疗有效且耐受性良好。因此，完善化疗方案并且联合MDLI有望成为恶性血液病移植后复发的主要治疗手段。
减少DLI后免疫抑制剂的应用能够增加其GVT，但并不能有效预防GVHD的发生，而经G-CSF动员的外周血造血干细胞虽然能够显著减少GVHD发生和增加GVT，但是如何能够在保证GVT的同时最大限度降低GVHD发生率，仍是目前研究的热点。Huang等[15]在MDLI后使用环孢素或甲氨蝶呤(10 mg×8 d后，改为每周使用1次，共持续2～4周)预防相关的GVHD的研究结果显示，短期应用免疫抑制剂能够显著减少MDLI相关的GVHD发生率，并且对GVT无影响。"微移植"技术在MDLI后，即使未采取任何预防GVHD的措施，但是在临床应用过程中也并未出现严重的GVHD表现[7,8]。因此，在造血干细胞输注后是否需要应用免疫抑制剂、免疫抑制剂应用时机及其有效性和安全性等问题，仍需要大量临床对照试验研究证实。
MDLI作为过继性细胞免疫治疗，可用于恶性血液病allo-HSCT后复发的预防及治疗[16]。目前，MDLI的临床应用时间相对较短，其输注时机、输注剂量、GVHD和GVT效应的平衡，以及如何完善细胞因子和化疗方案，输注后是否使用免疫抑制剂等问题，仍进一步研究。总而言之，随着对移植免疫机制研究的不断深入，如何更好地分离GVHD和GVT，创造出外周造血干细胞输注新模式是MDLI的发展方向，也将成为治疗血液系统恶性肿瘤的新里程碑。
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