探讨p16基因缺失在成人Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ ALL）中的临床意义。
回顾性分析80例Ph+ALL伴p16基因缺失患者的临床特征、免疫表型、细胞遗传学、分子生物学改变及其预后。
31.3% Ph+ALL患者合并p16基因缺失；p16基因缺失组与非缺失组相比，初诊时高白细胞计数（WBC≥30×109/L）更常见，高表达CD20，更易出现附加染色体异常，其中以累及7、8、19号染色体以及der（22）较为常见；两组诱导缓解率比较差异无统计学意义（P=0.033），p16基因缺失组患者治疗3个疗程后获BCR-ABL融合基因主要分子学反应（MMR）率和完全分子学反应（CMR）率均明显低于非缺失组（P值分别为0.034和0.036），且复发率明显高于非缺失组（P=0.033）；p16基因缺失组使用伊马替尼联合化疗者和使用达沙替尼联合化疗者的MMR、CMR率及复发率差异均无统计学意义（P值均>0.05）；p16基因缺失组患者3年总体生存（OS）率及无病生存（DFS）率分别为37.1%和12.4%，显著低于非缺失组的54.1%和45.9%（P值分别为0.037和0.026）；25例p16基因缺失患者中14例行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT），其中位OS时间为21个月，明显长于非移植组患者的12个月（P=0.030）。
成人Ph+ALL伴p16基因缺失患者预后相对较差，二代酪氨酸激酶抑制剂不能明显改善其疗效，但allo-HSCT能够改善部分患者的生存，明确p16基因缺失状态对于评估预后和指导临床治疗有重要意义。
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Ph染色体是急性淋巴细胞白血病（ALL）常见的细胞遗传学异常，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）联合化疗及异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）可显著改善Ph+ALL的预后，但是仍有部分患者出现耐药、复发甚至疾病进展[1]。TKI耐药仍是目前Ph+ALL治疗的一大难点，因此，探讨TKI耐药机制以及寻找新的预后标志对于该部分患者显得尤其重要。染色体9p21的异常在多种肿瘤的发生发展中起重要作用[2]。目前已经发现在9p21区域有CDKN2A（p16）和CDKN2B（p15）两个重要的抑癌基因，它们分别编码p16（INK4a）/p14（ARF）和p15（INK4b）周期蛋白，构成了一个重要的抑癌基因簇[3]。在ALL中，18.2%~45.0%的患者可以检测到p16基因缺失，我们前期研究及目前文献报道p16基因缺失可能是ALL预后不良的独立危险因素[4,5]。本研究中我们应用FISH技术检测80例初诊Ph+ALL患者p16基因缺失情况，并进一步分析该基因缺失与Ph+ALL患者临床特征、疗效及预后关系。
对2010年1月至2015年4月就诊于我院血液科的80例初诊Ph+ALL患者的临床资料进行回顾性分析，所有患者均根据临床表现、骨髓细胞形态学、免疫分型、细胞遗传学及分子生物学结果进行诊断，符合WHO（2008）急性白血病诊断标准。骨髓细胞核型分析采用常规G显带法。骨髓细胞免疫表型分析采用流式细胞术检测淋系和髓系抗原。BCR-ABL mRNA检测采用常规实时荧光定量PCR（RQ-PCR）方法，以ABL作为内参基因，BCR-ABL mRNA水平以BCR-ABL/ABL基因转录本拷贝数×100%表示，敏感度为MR4.5（BCR-ABLIS=0.0032%）[6]。
针对p16基因缺失的预包被式探针诊断系统购于英国Cytocell公司，按设计组合标记固定于一张检测玻片，按试剂盒说明书进行操作。探针组包括：覆盖9p21区域101 kb的红色探针，9号染色体质控探针（D923，9q12上的异染色质块，绿色）。正常细胞的荧光原位杂交信号为2红2绿，1红2绿表明p16基因从1条染色体中缺失，即杂合性缺失，0红2绿为纯合性缺失（图1）。杂合性缺失与纯合性缺失均定义为缺失。根据ISCN（2005）标准分析检测结果，每份间期核标本计数200个细胞[7]。
A：正常细胞；B：杂合性缺失；C：纯合性缺失
所有Ph+ALL患者均首先予VILP（长春新碱、去甲氧柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、泼尼松）或VDLP（长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、泼尼松）方案进行诱导化疗，明确诊断后尽早联合TKI药物治疗（伊马替尼400 mg每日1次或达沙替尼100 mg每日1次）。诱导缓解后予Hyper CVAD-A（环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、地塞米松）方案和Hyper CVAD-B（大剂量甲氨蝶呤和阿糖胞苷）方案交替巩固治疗。其中54例患者在巩固化疗2~5个疗程后进行allo-HSCT。对所有患者均进行腰椎穿刺并鞘内注射药物（阿糖胞苷+甲氨蝶呤+地塞米松）预防中枢神经系统白血病。
首疗程诱导治疗结束后行骨髓细胞形态学检查，评价血液学缓解情况；3个疗程后疗效评价主要根据细胞分子学反应。完全缓解（CR）定义为化疗后患者骨髓中原始细胞≤0.050，外周血中性粒细胞绝对计数≥1.5×109/L，PLT≥100×109/L，白细胞分类中无白血病细胞，无髓外白血病。主要分子学反应（MMR）定义为BCR-ABL mRNA较治疗前下降至少3个对数级（BCR-ABL/ABL≤0.1%）。完全分子学反应（CMR）定义为BCR-ABL mRNA拷贝数低于检测极限水平（BCR-ABL/ABL≤0.0032%）[6,8]。复发定义为获得CR患者骨髓中原始细胞≥0.050或者发生髓外侵犯。总生存（OS）时间指从诊断起至患者死亡（包括任何原因）或末次随访日止。无病生存（DFS）时间定义为自CR至白血病复发或在CR期间死亡或末次随访日。随访截止日期为2016年5月4日。
应用SPSS 20.0统计学软件进行分析，样本均数的比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，生存率的比较采用Log-rank检验，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。
本组80例成人Ph+ALL患者中位年龄33.5（18~61）岁。25例（31.3%）患者检出p16基因缺失，其中1例为杂合缺失，24例为纯合缺失。p16基因缺失与未缺失组相比，性别、年龄、中位WBC、骨髓中原始细胞比例、肝脾肿大及髓外浸润情况等差异均无统计学意义（P值均>0.05）。p16基因缺失患者初发高白细胞（WBC≥30×109/L）比非缺失组更常见（P=0.042）（表1）。在p16基因缺失组中，除外2例核型分析失败的患者，余23例中18例（78.3%）初诊核型分析存在Ph染色体伴附加染色体异常，发生率较非缺失组高（P=0.035），其中以累及7号染色体（4例，3例-7，1例7q-）、8号染色体（4例，3例易位）、19号染色体（3例，2例-19，1例+19）和der（22）（4例）更为常见。此外，本组病例中发现的Ph染色体变异型易位有t（8;9;22）（q21;q34;q11）、t（4;9;22）（q21;q34;q11）、t（9;9;22）（q22;p24;q11）。
伴p16基因缺失Ph+急性淋巴细胞白血病患者临床及实验室特征
伴p16基因缺失Ph+急性淋巴细胞白血病患者临床及实验室特征
| 特征 | 缺失阳性组（25例） | 缺失阴性组（55例） | 检验值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 中位年龄［岁，M（范围）］ | 34（18~60） | 28（18~61） | -1.610a | 0.111 | |
| 性别（例，男/女） | 17/8 | 34/21 | 0.284 | 0.594 | |
| WBC［×109/L，M（范围）］ | 49.72（1.70~255.96） | 39.00（1.78~808.00） | 0.539a | 0.592 | |
| WBC≥30×109/L［例（%）］ | 20（80.0） | 31（56.4） | 4.155 | 0.042 | |
| 骨髓原始细胞［M（范围）］ | 0.838（0.400~0.995） | 0.816（0.260~0.995） | -0.549a | 0.584 | |
| 肝脾肿大［例（%）］ | 10（40.0） | 14（25.4） | 1.732 | 0.188 | |
| 髓外浸润［例（%）］ | 4（16.0） | 12（21.8） | 0.364 | 0.546 | |
| CD20阳性［例（%）］ | 14（56.0） | 17（30.9） | 4.558 | 0.033 | |
| 细胞遗传学异常［例（%）］ | 4.461 | 0.035 | |||
| 单纯Ph染色体 | 5（21.7） | 23（47.9） | |||
| Ph伴附加染色体 | 18（78.3） | 25（52.1） | |||
| 首疗程完全缓解［例（%）］ | 21（84.0） | 51（92.7） | 1.455 | 0.228 | |
| 获主要分子学反应［例（%）］ | 4（16.0） | 22（40.0） | 4.513 | 0.034 | |
| 获完全分子学反应［例（%）］ | 2（8.0） | 16（29.1） | 4.384 | 0.036 | |
| 造血干细胞移植［例（%）］ | 14（56.0） | 40（72.7） | 2.192 | 0.139 | |
| 复发［例（%）］ | 15（60.0） | 19（34.5） | 4.557 | 0.033 | |
注：检验值中a为t值，余均为χ2值
对80例成人Ph+ALL患者骨髓细胞进行免疫表型分析，CD抗原表达>20%为阳性。p16基因缺失与未缺失组相比，除CD20外，两组间CD45、CD13、CD14、CD15、CD117、CD33、CD34、CD38、HLA-DR、CD10、CD19、CD22、CD2、CD3、CD7、CD11b、CD56等表达差异均无统计学意义（P值均>0.05），p16基因缺失患者多合并CD20表达（P=0.033）。
p16基因缺失组使用VDLP诱导方案14例，VILP诱导方案11例，非缺失组分别为37例和18例，两组差异无统计学意义（P=0.331）。p16基因缺失组与非缺失组患者化疗联合伊马替尼治疗分别为13例和29例，联合达沙替尼治疗分别为12例和26例，两组差异无统计学意义（P=0.952）。p16基因缺失组与非缺失组相比，首疗程诱导治疗CR率差异无统计学意义（84.0%对92.7%，P=0.249）。p16基因缺失组治疗3个疗程后MMR率为16.0%，CMR率为8.0%，显著低于非缺失组的40.0%和29.1%（P值分别为0.034和0.036）（表1）。两组患者BCR-ABL转录本均以P190为主，p16基因缺失组中P190阳性19例，p210阳性6例，非缺失组分别为40例和15例，差异无统计学意义（P=0.758）。p16基因缺失组中15例（60.0%）患者出现复发（血液学或中枢神经系统复发），复发率明显高于非缺失组（34.5%，P=0.033）。p16基因缺失组患者中化疗联合伊马替尼治疗13例，联合达沙替尼治疗12例，两者的MMR（15.4%对16.7%，P=0.930）、CMR率（7.7%对8.3%，P=0.953）及复发率（61.5%对58.3%，P=0.870）差异均无统计学意义。
80例成人Ph+ALL患者中54例在巩固化疗2~5个疗程后进行allo-HSCT，其中p16基因缺失组14例，非缺失组40例，截至末次随访，80例患者中位随访时间为19.5（2~79）个月。p16基因缺失组和非缺失组患者中位生存时间分别为18和47个月（P=0.037）。p16基因缺失组患者3年OS率及DFS率分别为37.1%、12.4%，而非缺失组分别为54.1%、45.9%，差异均有统计学意义（P值分别为0.026和0.030）（图2、图3）。p16基因缺失患者中移植组中位生存时间为21个月，非移植组为12个月（P=0.030）（图4）。
2014年NCCN指南中将ALL分为高危组和标危组，定义高危组ALL的危险因素有：①Ph阳性或BCR-ABL基因阳性；②t（v;11q23）或MLL基因重排；③诊断时WBC≥30×109/L（B-ALL），≥100×109/L（T-ALL）；④低二倍体（染色体数<44条）。标危组ALL则不具有上述任何危险因素之一[7]。近年基于疾病危险度的分层诊断和TKI的应用及allo-HSCT方案的优化显著改善了Ph+ALL患者的预后，但是仍有部分患者出现复发，难以从目前的诊疗中获益，强烈提示此类疾病需要再分层。我们曾报道p16基因缺失儿童和成人B-ALL患者预后相对较差[4, 9]，且国外有报道，p16基因缺失是Ph+ALL除BCR-ABL融合基因外最常见的基因突变之一，其检出率为29.2%~64.0%[10,11]。Mullighan等[12]还发现Ph+ALL和慢性髓性白血病ALL变患者伴p16基因缺失的细胞遗传学改变可能是影响伊马替尼疗效的原因之一。
本研究结果显示，p16基因缺失在成人Ph+ALL中的发生率为31.3%，与文献[9、10、11]报道相符。我们发现，p16基因缺失组患者具有初诊高白细胞（WBC≥30×109/L）、CD20阳性率高以及伴随附加染色体异常更常见的特点。目前CD20阳性对Ph+ ALL预后的影响仍然存在争议[13,14]，但是多数研究认为CD20阳性与ALL复发率增高、CR持续时间缩短及生存率降低密切相关[15,16]，利妥昔单抗联合标准化疗能有效延长60岁以下CD20阳性ALL患者的OS时间[16]。基于上述研究及我们发现p16基因缺失组患者更容易高表达CD20、预后差、复发率高等特点，我们研究组推测利妥昔单抗有可能改善p16基因缺失患者的预后，但目前无相关报道，仍需进一步研究证实。本研究结果还显示，p16基因缺失组患者更易伴随附加染色体异常，可能主要因为p16基因可以通过抑制CDK4/6-cyclinD复合物激酶活性，使Rb呈持续高磷酸的活化状态，从而抑制细胞由G1期进入到S期，导致细胞周期停滞[3,17]。本研究中p16基因缺失患者出现附加染色体异常以累及7、8、19号染色体以及der（22）更为常见，Wetzler等[18]的研究亦表明Ph+ALL患者伴7号染色体异常和der（22）异常往往提示预后不良。
我们在研究中发现，Ph+ ALL伴p16基因缺失患者治疗效果差，复发率高，3年OS及DFS率明显低于非缺失患者，与国外大部分报道一致[19,20,21]。p16基因缺失组患者中化疗联合伊马替尼治疗13例，联合达沙替尼治疗12例，两者的MMR、CMR、复发率差异无统计学意义。早有报道伊马替尼治疗p16基因缺失Ph+ALL的效果不佳[12]，Williams等[22,23]通过用BCR-ABL基因转染p16基因缺失的小鼠骨髓细胞发现，该小鼠对伊马替尼治疗敏感性差，并且证实p16基因缺失通过细胞因子IL-7依赖形式诱导细胞对伊马替尼耐药。目前越来越多的报道显示，二代TKI（达沙替尼）联合化疗可明显改善Ph+ ALL疗效及预后[24,25]，国外多中心研究发现仅接受达沙替尼联合化疗治疗的Ph+ALL患者可获得持续缓解和长期生存（中位OS时间为55个月）[24]。而本研究发现，Ph+ALL伴p16基因缺失患者应用二代TKI如达沙替尼并不能获得更深层次的MMR以及减少复发，也许与本研究病例数少有关。目前尚缺少针对p16基因缺失的靶向治疗药物，但我们的研究结果显示，allo-HSCT能够改善伴p16基因缺失患者的预后，为该部分患者的治疗选择提供了数据。
综上所述，成人Ph+ALL伴p16基因缺失的患者预后相对较差，使用二代TKI不能明显改善该部分患者的疗效，但allo-HSCT能够延长患者的生存时间，因此，明确p16基因缺失状态对于Ph+ALL预后评估和指导临床治疗具有重要意义。
