ABCB11基因编码胆盐输出泵(BSEP)蛋白，BSEP蛋白主要位于肝细胞胆管膜上，是胆汁分泌的重要转运蛋白之一，当ABCB11基因发生突变时，BSEP蛋白功能、定位以及降解等发生异常，导致胆汁排出受阻，形成肝内胆汁淤积症。近年来，ABCB11基因突变的膜定位机制成为研究热点。现就ABCB11基因突变导致肝内胆汁淤积机制最新研究进展进行综述，详细介绍BSEP膜定位机制及4-苯丁酸治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症2型的研究进展，为进一步研究奠定基础。
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肝脏的主要作用之一是合成和分泌胆汁酸，而胆盐输出泵(bile salt export pump，BSEP)是肝内胆汁分泌的主要转运蛋白之一，BSEP几乎均特异性地表达于毛细胆管面的肝细胞膜上，属于跨膜蛋白，主要功能是与单价胆汁酸盐(如牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、鹅脱氧胆酸等)和某些药物(如环孢素、利福平、格列本脲、普伐他汀等)结合，通过水解ATP将胆盐等逆浓度梯度泵入毛细胆管内[1,2]。ABCB11基因编码BSEP蛋白，当ABCB11基因发生突变时，BSEP蛋白合成和功能异常，进而使胆汁排出受阻，导致肝内胆汁淤积。在临床上，由ABCB11基因突变导致的肝内胆汁淤积主要分为4种：进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(progre-ssive familial intrahepatic cholestasia type 2，PFIC2)、良性复发性肝内胆汁淤积症2型(benign recurrent intrahepatic cholestasis type 2，BRIC2)、药物性肝内胆汁淤积症(drug－induced cholestasis，DIC)和妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)。其中，PFIC2患儿疾病进展迅速，最终出现肝硬化、肝衰竭，常需进行肝移植，同时也是肝细胞癌和胆管细胞癌的高危人群[3,4]。目前，ABCB11基因突变导致肝内胆汁淤积机制尚不完全清楚，现对其最新进展进行综述。
ABCB11基因位于人类第2号染色体长臂的2q24-31。BSEP蛋白由1 321个氨基酸组成，相对分子质量约为160 000，在分子水平上，BSEP由12个跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)和2个核苷酸结合域(nucleotide binding domain，NBD)构成，按TMD-NBD-TMD-NBD的形式排列。TMD和NBD突变均会影响BSEP蛋白的结构和功能[5,6]。
正常情况下，BSEP蛋白在糙面内质网中合成、折叠，并完成初级糖基化，经高尔基体进一步加工修饰后，转运到反面高尔基体管网状结构，经分选输出后，先转运到顶端循环内体，再到胆汁腔面。BSEP在胆汁腔面经内吞后[此过程利用网格蛋白-内吞机制，涉及HS1相关蛋白X-1(HS1-associated protein X-1，HAX-1)、皮层蛋白等]，可能在顶端膜早期内体、顶层下区室和顶端循环内体间进行循环转运，最后到达胆汁腔面发挥转运功能[7]。而关于BSEP蛋白的膜定位机制，研究发现主要与以下蛋白有关：(1)肝激酶B1(liver kinase B1，LKB-1)。Homolya等[8]在小鼠及肝细胞模型中均发现，LKB-1基因敲除后，ABCB11大多滞留在细胞内，而不是定位到胆管膜上发挥其转运功能。且当LKB-1表达减少时，其下游的腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)表达亦降低，最终影响肝细胞极性及蛋白的翻译调控[9]。(2)HAX-1蛋白。Ortiz等[10]发现HAX-1和BSEP蛋白的细胞内连接域相结合可以调节BSEP在犬肾上皮细胞 Ⅱ(MDCK Ⅱ)顶膜中的表达丰度，抑制HAX-1表达可使BSEP在MDCK Ⅱ 细胞顶膜的表达增加71%，说明HAX-1在BSEP的膜定位中发挥重要作用。Kong等[11]也用免疫共沉淀法证实，给予高脂饮食的C57L小鼠肝细胞中HAX-1和BSEP亲合力增强，可以使BSEP在肝细胞膜上的表达减少。进一步提示HAX-1和BSEP亲和力的增强可以影响BSEP的膜定位过程。(3)接头蛋白复合体2(adaptor protein complex 2，AP2)。Hayashi等[12]对大鼠进行研究发现，4-苯丁酸(4-phenylbutyrate，4-PB)通过抑制E297G突变型和D482G突变型BSEP的内化及减慢其在胆管膜的降解，从而达到增强大鼠肝细胞胆管膜面的BSEP表达，改善肝内胆汁淤积症的作用，其并不改变BSEP信使RNA的水平。进一步研究证实，在这一过程中，4-PB抑制AP2的α和μ1亚基的表达，从而影响BSEP的胞吞作用，增加其在肝细胞胆管膜上的表达。(4)肌球蛋白 Ⅱ 调节轻链(MLC2)。MLC2与BSEP的NBD结构域相互作用，在BSEP定位到胆管细胞膜过程中起重要作用，最新研究表明，钙离子的减少导致BSEP胞吞作用的增加，使得胆汁酸分泌减少[13]。
法尼酯受体(farnesoid X-receptor，FXR)是BSEP蛋白转录与表达调控的最重要因子。胆汁酸可以与FXR配体结合域结合，其中，疏水性的鹅去氧胆酸是FXR最强的内源性配体，结合的FXR与视黄醇受体(retinoid X receptor，RXR)形成异源二聚体，结合到靶基因启动子上的FXR反应元件(IR-1)上，从而发挥转录调节作用。而BSEP启动子上含有FXR的反应元件，FXR可以激活BSEP的转录。近来一项临床研究中，在对有FXR突变(c.526C>T)且无ABCB11基因突变的患儿进行肝脏切片免疫组织化学发现，BSEP和FXR均未见表达，进一步说明FXR对BSEP的转录起重要调节作用[14]。
此外，BSEP蛋白的转录及表达也受到其他因子的调控。肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1，LRH1)基因敲除小鼠的BSEP表达水平较野生小鼠低，LRH1是通过激活BSEP的启动子和调节胆汁酸、FXR水平来达到提高BSEP表达的目的[15]。Weerachayaphorn等[16]研究发现，核因子E2相关因子2(nf-e2-related factor 2，NRF2)的激动剂奥替普拉使HepG2细胞中BSEP信使RNA的表达增加了7倍，人肝细胞中BSEP蛋白表达增加了70%，而小干扰RNA降低NRF2表达的同时抑制奥替普拉对BSEP的表达上调作用。当然，BSEP的转录也受到许多因素的负性调控作用。石胆酸是FXR的拮抗剂，下调BSEP基因表达，而脂多糖通过作用于细胞因子白细胞介素(IL)-6、IL-1α和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)影响BSEP的表达导致胆汁淤积。
ABCB11基因包括1个位于5′末端的非编码外显子和27个编码外显子，不同基因位点的突变对BSEP合成和功能的影响也不同。ABCB11基因突变主要有错义突变、无义突变、缺失或插入和剪切位点突变。这些突变无疑会对BSEP的合成、折叠、定位及降解等过程产生影响，最终使得肝细胞胆管膜上的BSEP蛋白含量减少或转运功能缺失。
无义突变可使正常BSEP蛋白的氨基酸序列截断，影响其蛋白稳定性及蛋白的准确定位[17]。而错义突变直接改变了BSEP蛋白的氨基酸序列，影响蛋白空间结构及蛋白的翻译后修饰，最终导致BSEP合成减少、膜定位降低及转运胆汁酸功能受损[17,18]。
剪切突变使mRNA的剪切发生异常，最终影响mRNA稳定性及BSEP蛋白表达量。在对5个确诊的PFIC2型患者肝组织的基因序列研究中发现：沉默子c.3003A>G突变和内含子c.3213＋4A>G突变均可造成剪切突变，使得mRNA的剪切发生异常，最终影响蛋白的准确定位及其功能[19]。
ABCB11基因突变使得BSEP的合成和功能异常，影响BSEP成功定位至胆管膜上发挥其功能，改变胆管膜上BSEP的半衰期，影响胆汁酸的排出，导致肝内胆汁淤积。
ABCB11基因突变对BSEP的合成、折叠、定位及降解等过程产生影响，使得BSEP蛋白的转运功能丧失。Stindt等[20]运用基因测序的方法发现了1个位于BSEP蛋白第6个跨膜结构域的突变型G374S，该突变的临床表型介于BRIC2和PFIC2之间，患儿在3年内进展为肝硬化，但免疫荧光检测发现肝细胞毛细胆管膜上存在BSEP蛋白的表达，进一步试验证实，G374S突变型的BSEP蛋白可以正常定位到胆管膜上，但其转运胆汁酸的能力大大降低，导致胆汁淤积。Francalanci等[21]在分析PFIC2患儿的新发突变R52W和H615R时发现突变位点分别位于跨膜结构域和核苷酸结合域，影响BSEP通过水解ATP发挥转运功能。
近年来，突变型BSEP蛋白的膜定位异常已经成为PFIC2的研究热点。正常情况下，BSEP蛋白定位于肝细胞胆管膜上发挥其功能，而某些基因突变会影响BSEP膜定位，使胆管膜上的BSEP蛋白表达减少，影响胆汁酸的转运，导致胆汁淤积。Naoi等[22]研究发现，在HEK293细胞中，qPCR检测发现野生型和R1231Q突变型BSEP的mRNA表达相似，但细胞表面生物素标记显示，细胞表面突变型BESP表达较野生型低得多。R1231Q突变型定位在内质网，提示R1231Q这一突变诱导了BSEP在内质网的不完全折叠，导致BSEP在胆管膜上表达减少，致使PFIC2的发生，而免疫印迹分析提示二者的转运能力无明显差别。近期一项临床试验发现，对携带R1128C突变的PFIC2患儿进行肝脏切片免疫组织化学，BSEP蛋白表达于细胞质中，在给予口服熊去氧胆酸的基础上，加用4-PB口服1个月后，BSEP表达于肝细胞胆管膜上且患儿临床症状得到缓解，加用4-PB同样可以纠正PFIC2患儿G982R、T1210P、R1231Q突变型蛋白的胆管膜定位，且患儿瘙痒症状明显好转，但具体机制目前尚不清楚[22,23]。
内质网相关蛋白降解(ERAD)途径是真核细胞蛋白降解的重要途径。错义突变导致错误折叠的蛋白通过ERAD途径降解可能是BSEP表达下降的一个原因，BSEP蛋白的单核苷酸多态性p.V444A增强了ERAD途径，降低了体外克隆的BSEP蛋白表达[24]。泛素-蛋白酶体途径是调节蛋白质降解与功能的重要系统，参与来自真核细胞的内质网、细胞表面的受体、通道以及转运蛋白的降解。BSEP泛素化可能诱发内吞作用，从而发起膜蛋白的降解。与野生型BSEP蛋白相比，PFIC2常见突变型E297G和D482G蛋白的短链泛素化占大比例，由此可以推断泛素化依赖的蛋白降解是基因突变BSEP蛋白半衰期缩短的原因[25]。
虽然PFIC2的确切发病率还未见报道，但目前缺乏有效的治疗方法，多很快进展到肝衰竭而需要进行肝移植，PFIC2已经严重危害到儿童的身体健康。近年来研究显示，4-PB可以纠正突变型BSEP蛋白的膜定位，延缓疾病进展，但具体机制尚不完全清楚[23]。所以有关突变型蛋白膜定位异常导致肝内胆汁淤积症，尤其是PFIC2的具体机制仍需进一步研究，以发现更多改变BSEP蛋白错误定位，从而延缓疾病进展，甚至取代肝移植的药物，改善PFIC2患儿的预后。
