张玉娇; 瞿文; 刘惠; 王一浩; 刘春燕; 李丽娟; 王化泉; 付蓉; 邢莉民; 邵宗鸿

doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.16.010

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• 临床研究 •

免疫性血小板减少症患者NK细胞数量及功能

中华医学杂志, 2017,97(16) : 1231-1235. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.16.010

摘要

目的

探讨免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血中自然杀伤(NK)细胞数量及功能的变化。

方法

选取2015年9月至2016年5月天津医科大学总医院血液科住院的初诊ITP患者34例，完全缓解ITP患者32例及健康志愿者30名。采用流式细胞术检测外周血NK细胞及其亚群比例，NK细胞表面分子激活性受体NKp44、抑制性受体NKG2A及CD16，胞质蛋白穿孔素及颗粒酶β的表达水平，并将其与ITP患者的免疫状态及血小板水平做相关性分析。

结果

(1)NK细胞及其亚群占外周血淋巴细胞比例：NK细胞：初诊组(10.99%±4.89%)及完全缓解组(9.73%±6.75%)低于对照组(14.67%±7.24%)(P＝0.023、0.003)；Bright亚群：初诊组(0.48%±0.23%)及完全缓解组(0.41%±0.33%)低于对照组(0.64%±0.32%)(P＝0.037、0.002)；Dim亚群：初诊组(10.16%±5.02%)及完全缓解组(8.07%±5.74%)低于对照组(14.16%±7.19%)(P＝0.009、0.007)。(2)各亚群占NK细胞的比例：Bright亚群：初诊组(6.48%±4.33%)高于对照组(4.21%±2.70%)(P＝0.020)；Dim亚群：初诊组(93.51%±4.33%)低于对照组(95.79%±2.70%)(P＝0.020)。(3)激活性受体NKp44：初诊组低于完全缓解组及对照组[0.28%(0.95%)比0.61%(2.05%)、0.92%(0.90%)，P＝0.047、0.048]；抑制性受体NKG2A：初诊组高于对照组(42.34%±23.86%比29.25%±12.83%，P＝0.009)；CD16：初诊组低于对照组(93.51%±4.33%比95.79%±2.70%，P＝0.020)。(4)穿孔素：初诊组低于对照组[87.52%(25.29%)比91.55%(8.29%)，P＝0.025]；颗粒酶β 3组之间差异无统计学意义。(5)NK细胞与外周血杀伤T细胞(CD3^＋CD8^＋)、B1细胞(CD5^＋CD19^＋)呈负相关(r＝－0.387、－0.273，P＝0.012、0.028)，与外周血辅助/杀伤T细胞比值(CD3^＋CD4^＋/CD3^＋CD8^＋)、血小板计数呈正相关(r＝0.358、0.314，P＝0.028、0.011)。

结论

ITP患者外周血NK细胞数量下降，发育障碍、功能降低，对自身反应性T、B细胞的抑制不足导致疾病的发生。

引用本文: 张玉娇, 瞿文, 刘惠, 等. 免疫性血小板减少症患者NK细胞数量及功能 [J] . 中华医学杂志, 2017, 97(16) : 1231-1235. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.16.010.

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免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是一种自身免疫介导血小板过度破坏所致的血小板减少性疾病，B淋巴细胞产生血小板相关抗体破坏血小板是ITP的经典发病机制。近年来有文献报道自然杀伤(NK)细胞在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)^[1]及类风湿性关节炎(RA)^[2]中存在数量及功能异常，且多数研究认为NK细胞在自身免疫性疾病中主要起保护作用。NK细胞在ITP患者中研究尚少，本研究通过检测ITP患者不同疾病状态及健康对照者外周血NK细胞数量、亚群及功能的变化，探讨NK细胞在ITP发病机制中的作用。

对象与方法

一、对象

1．病例来源：

选取2015年9月至2016年5月天津医科大学总医院血液科住院的初诊ITP患者(初诊组)34例，男14例，女20例，中位年龄50岁(14～65岁)，均未接受免疫治疗，血小板计数<60×10⁹/L ；完全缓解组ITP患者32例，男10例，女22例，中位年龄42岁(9～71岁)，均已接受免疫治疗，血小板计数维持在(100～300)×10⁹/L；健康志愿者30名作为对照组，男9名，女21名，中位年龄41岁(14～69岁)。初诊组及完全缓解组ITP患者均符合该疾病的诊断标准，且通过完善骨髓涂片、流式表型、染色体、甲状腺功能、免疫全项、腹部B超等检查排除了SLE等自身免疫性疾病、甲状腺疾病、骨髓增生异常综合征或淋巴瘤所致的血小板减少，同时也除外了脾功能亢进、假性及妊娠情况所致的血小板减少，所选受试者无感染、肿瘤及其他自身免疫性疾病等影响NK细胞水平等因素的干扰。3组间性别、年龄差异无统计学意义(均P>0.05)。研究方案经天津医科大学总医院伦理委员会批准，所有研究对象均已签署知情同意书。

2．ITP患者治疗方案及疗效标准：

纳入本研究的ITP患者治疗方案均使用糖皮质激素(1 mg·kg^－1·d^－1)，根据病情严重程度，部分患者加用丙种球蛋白(400 mg·kg^－1·d^－1×5 d)和环孢素(3～5 mg·kg^－1·d^－1)联合治疗。ITP诊断及疗效标准参照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》^[3]。

3．初诊组ITP患者亚组分组标准：

将初诊组ITP患者中接受治疗后血小板计数恢复至>100×10⁹/L的患者归为初诊治疗有效组，男9例，女14例，中位年龄52岁(22～66岁)；接受糖皮质激素治疗无效或有效但疗效不能维持、大剂量丙种球蛋白及免疫抑制剂治疗无效的患者归为初诊难治性ITP组，男5例，女6例，中位年龄47岁(14～64岁)，两组间性别、年龄差异无统计学意义(均P>0.05)。

二、方法

1．主要试剂及仪器：

鼠抗人多甲藻素-叶绿素蛋白标记的CD3抗体(PerCP-CD3)、鼠抗人藻蓝蛋白标记的CD56抗体(APC-CD56)、鼠抗人异硫氰酸荧光素标记的CD16抗体(FITC-CD16)、鼠抗人藻红蛋白标记的激活性NKp44受体抗体(PE-NKp44)、鼠抗人藻红蛋白标记的抑制性NKG2A受体抗体(PE-NKG2A)、鼠抗人藻红蛋白标记的穿孔素抗体(PE-穿孔素)、鼠抗人藻红蛋白标记的颗粒酶β抗体(PE-颗粒酶β)，均购自美国Becton Dickinson公司；各抗体同型对照，溶血素及破膜剂购自美国BD公司；流式细胞仪为FACSCalibur型，美国BD公司产品。

2．流式细胞术(FCM)检测NK细胞及其亚群的数量：

取新鲜抗凝血200 μl，平分为2管，检测管1中加入同型对照IgG1-PerCP、IgG1-FITC、IgG1-APC各20 μl，检测管2中加入CD3-PerCP、CD56-APC和CD16-FITC各20 μl。4 ℃避光孵育30 min后加入2 ml溶血素，摇匀后室温避光8 min溶解红细胞，离心弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，使用流式细胞仪计数30 000个细胞检测NK细胞的数量。

3．FCM检测NK细胞表面受体：

取新鲜抗凝血300 μl，平均分为3管，检测管1中加入同型对照IgG1-PerCP、IgG1-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE各20 μl，检测管2中加入CD3-PerCP、CD56-APC、CD16-FITC及NKp44-PE各20 μl，检测管3中加入CD3-PerCP、CD56-APC、CD16-FITC及NKG2A-PE各20 μl，4 ℃避光孵育30 min后加入2 ml溶血素，摇匀后室温避光8 min溶解红细胞，离心弃上清，PBS洗涤后加入PBS 300 μl，使用流式细胞仪计数30 000个细胞检测NK细胞表面受体的表达水平。

4．FCM检测NK细胞胞质蛋白穿孔素、颗粒酶β：

取新鲜抗凝血300 μl，平分为3管，检测管1中加入同型对照IgG1-PerCP、IgG1-FITC、IgG1-APC各20 μl，检测管2中加入CD3-PerCP、CD56-APC和CD16-FITC各20 μl，检测管3中加入CD3-PerCP、CD56-APC和CD16-FITC各20 μl，混匀，4 ℃避光孵育30 min，加入2 ml溶血素，室温避光8 min溶解红细胞，离心弃上清，将600 μl破膜剂加入上述溶血后的标本，室温避光10 min破膜固定，PBS洗1次，离心弃上清后分别加入抗体IgG1-PE、穿孔素-PE、颗粒酶β-PE各20 μl，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤后各加入300 μl PBS，使用流式细胞仪计数50 000细胞检测NK细胞胞质蛋白穿孔素、颗粒酶β的表达水平。

三、统计学方法

使用SPSS 20.0统计软件。构成比之间比较(如性别)采用χ²检验。对于符合正态分布方差齐的计量资料以±s表示，两组间比较使用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关分析采用Pearson相关分析；对非正态分布、方差不齐的变量值，用M(Q_R)表示，采用非参数检验。相关分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．NK细胞及其亚群占外周血淋巴细胞的比例：

初诊组及完全缓解组NK细胞占外周血淋巴细胞比例低于对照组(P＝0.023、0.003)；初诊组及完全缓解组Bright亚群占外周血淋巴细胞比例低于对照组(P＝0.037、0.002)；初诊组及完全缓解组Dim亚群占外周血淋巴细胞比例低于对照组(P＝0.009、0.007)(表1)。初诊患者中治疗有效组(11.71%±5.5%)高于难治组(7.97%±3.07%，P＝0.045)。

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表1

流式细胞术检测各组自然杀伤(NK)细胞及其亚群占外周血淋巴细胞的比例(%，±s)

表1

流式细胞术检测各组自然杀伤(NK)细胞及其亚群占外周血淋巴细胞的比例(%，±s)

组别	例数	NK细胞	Bright亚群	Dim亚群
初诊组	34	10.99±4.89^a	0.48±0.23^a	10.16±5.02^a
完全缓解组	32	9.73±6.75^a	0.41±0.33^a	8.07±5.74^a
对照组	30	14.67±7.24	0.64±0.32	14.16±7.19

注：与对照组比较，^aP<0.05

2．NK细胞亚群占NK细胞的百分比：

初诊组Bright亚群占NK细胞的百分比(CD3^－CD56^BrightCD16^－/CD3^－CD56^＋ )高于对照组(P＝0.020)，Dim亚群占NK细胞的百分比(CD3^－CD56^DimCD16^＋/CD3^－CD56^＋)低于对照组(P＝0.020)(表2)。

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表2

流式细胞术检测各组自然杀伤(NK)细胞亚群占NK细胞的比例(%，±s)

表2

流式细胞术检测各组自然杀伤(NK)细胞亚群占NK细胞的比例(%，±s)

组别	例数	Bright亚群	Dim亚群
初诊组	34	6.48±4.33^a	93.51±4.33^a
完全缓解组	32	5.52±4.17	94.47±4.17
对照组	30	4.21±2.70	95.79±2.70

注：与健康对照组比较，^aP<0.05

3．NK细胞表面分子及胞质蛋白的表达：

激活性受体NKp44：初诊组低于完全缓解组及对照组(P＝0.047、0.048)，抑制性受体NKG2A：初诊组显著高于对照组(P＝0.009)，CD16：初诊组显著低于对照组(P＝0.020)；穿孔素：初诊组显著低于对照组(P＝0.025)，颗粒酶β三组之间差异无统计学意义(P＝0.560、0.426、0.179)(表3)。

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表3

自然杀伤(NK)细胞表面分子及胞质蛋白的表达[%，±s或M(Q_R)]

表3

自然杀伤(NK)细胞表面分子及胞质蛋白的表达[%，±s或M(Q_R)]

组别	例数	NK细胞表面分子			NK细胞胞质蛋白
组别	例数	NKp44	NKG2A	CD16	穿孔素	颗粒酶β
初诊组	34	0.28(0.95)	42.34±23.86	93.51±4.33	87.52(25.29)	87.09±10.32
完全缓解组	32	0.61(2.05)^a	34.57±20.01	94.47±4.17	89.74(16.40)	85.67±10.56
对照组	30	0.92(0.90)^a	29.25±12.83^a	95.79±2.70^a	91.55(8.29)^a	89.05±8.29

注：与初诊组比较，^aP<0.05

4．相关性分析：

NK细胞占外周血淋巴细胞比例与ITP患者外周血CD3^＋CD4^＋T细胞、补体C3、补体C4、血小板抗体(CD41a^＋IgG、CD41a^＋IgM)水平、血清IgG、血清IgM、血清IgA、血清IgE、均无明显的相关性(r＝－0.033、－0.168、－0.064、－1.380、0.026、－0.085、0.040、－0.007、－0.064，均P>0.05)，与B1细胞(CD5^＋CD19^＋)呈负相关(n＝66，r＝－0.273，P＝0.028)(图1)，与外周血杀伤T细胞(CD3^＋CD8^＋)呈负相关(n＝41，r＝－0.387，P＝0.012)(图2)，与外周血辅助/杀伤T细胞比值(CD3^＋CD4^＋/CD3^＋CD8^＋)呈正相关(n＝41，r＝0.358，P＝0.028)(图3)，与外周血血小板计数呈正相关(n＝66，r＝0.314，P＝0.011)(图4)。

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图1

免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血自然杀伤(NK)细胞占淋巴细胞比例与B1细胞的相关性

图2

ITP患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例与杀伤T细胞的相关性

图3

ITP患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例与辅助/杀伤T细胞比值的相关性

图4

ITP患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例与外周血血小板水平的相关性

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图1

免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血自然杀伤(NK)细胞占淋巴细胞比例与B1细胞的相关性

图2

ITP患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例与杀伤T细胞的相关性

图3

ITP患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例与辅助/杀伤T细胞比值的相关性

图4

ITP患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例与外周血血小板水平的相关性

讨论

ITP是最常见的自身免疫性出血性疾病，其发病机制除了经典的自身反应性B细胞产生抗体破坏血小板的发病机制外，还与CD8^＋ T细胞对血小板及巨核细胞的直接破坏有关^[4]，另外，DC亚群失衡、调节性B细胞(Breg细胞)功能下降等因素也被认为与ITP发病相关^[5,6]。近些年NK细胞作为一种免疫调节细胞在自身免疫性疾病也越来越受到关注。研究发现SLE患者外周血中NK细胞数量、细胞杀伤活性显著降低，且合并关节炎和血小板减少的患者NK细胞数量的减少更加显著，认为NK细胞在疾病中主要起保护性作用^[1]。此外RA^[7]、Graves病^[8]中也有类似发现。在ITP患者体内，也有研究发现NK细胞的数量是降低的，且病情越重，NK细胞数量降低越明显^[9,10]，另外，Ebbo等^[11]将ITP患者及健康对照组脾脏中的NK细胞与K562细胞共培养，发现ITP患者NK细胞的杀伤功能下降。

NK细胞有重要的免疫调节作用，NK细胞对B细胞的分化有抑制作用，并且激活的NK细胞能够抑制B细胞产生自身抗体^[12]，成熟的CD8^＋T细胞虽然是有功能的，但因其缺乏主要组织相容性复合体-Ⅰ(MHC-Ⅰ)类分子而更容易被NK细胞杀伤^[13]。成熟的NK细胞基于CD56的表达情况，可以分为两个亚群：CD56^BrightNK亚群和CD56^DimNK亚群。CD56^BrightNK亚群处于NK细胞发育成熟的较早期阶段，CD56^DimNK处于较成熟阶段，CD56^DimNK来源于CD56^BrightNK细胞，在NK细胞的发育过程中，NKG2A最先表达，之后是抑制性的免疫球蛋白样受体(KIR类)，CD16在分化发育的后期表达^[14]。

本研究不同于以往文献仅检测了NK细胞数量的变化，同时亦检测了其亚群组成的变化，表面受体及胞质蛋白的表达，并与ITP患者的免疫指标、临床指标及血小板水平做了相关性分析，检测NK细胞的功能指标更加全面，因此更具有代表性。本研究发现初诊ITP患者NK细胞及其亚群比例显著低于健康对照组，而初诊ITP患者经治疗后治疗有效组NK细胞比例显著高于难治组，提示ITP患者体内NK细胞数量减少，但经免疫治疗后得以提升；初诊ITP患者外周血CD56^Bright亚群所占NK细胞的比例显著高于健康对照组，而其CD56^Dim亚群较对照组降低，早期标志性抗原NKG2A初诊组显著高于对照组，晚期表达抗原CD16初诊组显著低于健康对照组，提示ITP患者体内NK细胞分化发育发生障碍，NK细胞没有完全分化，停留在早期阶段的NK细胞增多。另外，NKG2A也是NK细胞的抑制性受体，其表达升高，而激活性受体NKp44显著降低，初诊组ITP患者外周血NK细胞穿孔素的表达较对照组减低，提示NK细胞的功能降低，穿孔素途径减弱可能是NK细胞数量及功能不足的一种"表现"，而我们将NK细胞与临床指标相关发现：NK细胞与外周血血小板计数呈正相关，与B1细胞及杀伤T细胞细胞呈负相关。由以上研究结果我们推测，ITP患者体内NK细胞数量减少、分化发育障碍、功能降低导致其对自身反应性B细胞、杀伤T细胞的抑制及杀伤不足，参与了疾病的发生。

在自身免疫性葡萄膜炎患者体内应用抗体封闭白细胞介素2受体(IL-2R)可以使调节性NK细胞扩增4～20倍，从而促进疾病的缓解。本研究发现ITP患者的NK细胞水平及功能减低，且与疾病严重程度相关。目前ITP的治疗主要是糖皮质激素、免疫抑制剂、丙种球蛋白等，是否可以通过体外扩增及自体回输NK细胞，为未来ITP的治疗提供了新的思路。

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贡献者信息

张玉娇

300052　天津医科大学总医院血液科

瞿文

300052　天津医科大学总医院血液科

刘惠

300052　天津医科大学总医院血液科

王一浩

300052　天津医科大学总医院血液科

刘春燕

300052　天津医科大学总医院血液科

李丽娟

300052　天津医科大学总医院血液科

王化泉

300052　天津医科大学总医院血液科

付蓉

300052　天津医科大学总医院血液科

邢莉民

300052　天津医科大学总医院血液科

邵宗鸿

300052　天津医科大学总医院血液科

通信作者

瞿文

300052　天津医科大学总医院血液科

Email：quwentj923@sina.com

关键词

血小板减少; 杀伤细胞，天然; 受体，自然杀伤细胞; 穿孔素; 颗粒酶类;

基金项目

国家自然科学基金（81170472、81370607、81400085、81400088）

天津市自然科学基金重点项目（12JCZDJC21500）

天津市抗癌重大专项攻关计划（12ZCDZSYl79000、12ZCDZSYl8000）

历史

出版日期：2017-04-25

收稿日期：2016-11-01

本文编辑

赵景辉

Clinical Research Article

Quantities and function of NK cells in patients with immune thrombocytopenia

Yujiao Zhang, Wen Qu, Hui Liu, Yihao Wang, Chunyan Liu, Lijuan Li, Huaquan Wang, Rong Fu, Limin Xing, Zonghong Shao

Published 2017-04-25

Cite as Natl Med J China, 2017, 97(16): 1231-1235. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.16.010

Abstract

Objective

To investigate natural killer (NK) cell quantities and function in patients with immune thrombocytopenia (ITP) .

Methods

A total of 66 ITP patients (34 newly diagnosed and 32 in complete remission) were collected from September 2015 to May 2016 in Tianjin Medical University General Hospital, and 30 healthy volunteers were recruited as controls. The percentages of NK cells and their subsets in peripheral blood, the expression of activating receptor (NKp44), inhibitory receptor (NKG2A) and CD16, perforin and granzyme β were detected by flow cytometry. The correlation between the above parameters and patients′ immune status and platelet level were evaluated.

Results

(1)The percentage of CD3^-CD56⁺ NK cells in newly diagnosed patients (10.99%±4.89%)and patients in complete remission (9.73%±6.75%) were significantly lower than that in healthy controls (14.67%±7.24%)(P=0.023, 0.003). The percentage of NK cells Bright subset was significantly lower in the newly diagnosed patients(0.48%±0.23%)and those in complete remission (0.41%±0.33%) than in healthy controls(0.64%±0.32%)(P=0.037, 0.002); the percentage of Dim subset was also significantly lower in the newly diagnosed (10.16%±5.02%) and patients in complete remission (8.07%±5.74%) than in healthy controls(14.16%±7.19%) (P=0.009, 0.007). (2)The proportion of Bright subset in total NK cells in new diagnosed ITP patients (6.48%±4.33%) was significantly higher than that in healthy controls (4.21%±2.70%)(P=0.020); the proportion of Dim NK cells subset in new diagnosed ITP patients (93.51%±4.33%) was significantly lower than that in healthy controls(95.79%±2.70%) (P=0.020). (3)The expression of activating receptor NKp44 in new diagnosed ITP patients was significantly lower than that in complete remission group and healthy controls[0.28%(0.95%)vs 0.61%(2.05%), 0.92%(0.90%); P=0.047, 0.048]; the expression of inhibitory receptor NKG2A in new diagnosed ITP patients was significantly higher than that in healthy controls(42.34%±23.86% vs 29.25%±12.83%, P=0.009). The proportion of CD16 was significantly lower in the newly diagnosed patients than in healthy controls(93.51%±4.33%比95.79%±2.70%, P=0.020). (4)The expression of perforin in the newly diagnosed ITP patients was significantly lower than that in healthy controls [87.52%(25.29%)vs 91.55%(8.29%), P=0.025]; the expression of granzyme β in ITP patients and controls showed no statistically significant difference. (5)The level of NK cells in ITP patients was negatively correlated with CD3⁺ CD8⁺ T cells (r=-0.387, P=0.012) and CD5⁺ CD19⁺ B cells in peripheral blood (r=-0.273, P=0.028), positively correlated with the ratio of CD3⁺ CD4⁺ /CD3⁺ CD8⁺ (r=0.358, P=0.028) and peripheral platelet count (r=0.314, P=0.011).

Conclusion

Deceased quantities and impaired total NK function, insufficient suppression of autoreactive T and B cells might play a role in the pathogenesis of ITP.

Key words:

Thrombocytopenia; Killer cells, natural; Receptors, natural killer cell; Perforin; Granzymes

Contributor Information

Yujiao Zhang

Department of Hematology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China

Wen Qu

Hui Liu

Yihao Wang

Chunyan Liu

Lijuan Li

Huaquan Wang

Rong Fu

Limin Xing

Zonghong Shao

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