组织工程学通过细胞或组织重建，修复缺损组织并保留其生物功能，成为气管替代治疗的新途径。种子细胞、生长因子及气管支架材料是组织工程气管的三大要素，学者们一直在寻求理想的种子细胞。间充质干细胞（MSCs）是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，广泛分布于骨髓、脐带、脂肪组织、心肌组织、大脑、肌肉和皮肤等，可向骨、软骨、脂肪、神经等多种细胞定向分化。MSCs具有增殖能力强、分化范围广、免疫调节等功能特点，能够修复损伤的组织，有望成为应用于组织工程气管的理想种子细胞。旨在对MSCs在组织工程气管中的应用作一综述。
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气管损伤主要由外伤、肿瘤、瘢痕、大面积烧伤等原因引起，先天性气管闭锁、气管插管或气管造口术后引起的气管狭窄均会导致患者出现严重的呼吸困难甚至窒息。端-端吻合术因其可以保留气管完好的解剖结构及连续性而被普遍认为是最有效的手术方式[1]；然而，当气管切除长度超过成人气管总长度的1/2（约6 cm）、婴幼儿气管总长度的1/3时，端-端吻合术成功率明显降低[2]，此时需要寻找合适的气管替代物。Neville等[3]提出理想的气管替代物需要保证以下特性：①管腔结构密封性。②质地柔韧性。③反应低炎性。④生物相容性。⑤低免疫排斥性。⑥利于上皮细胞生长性。而气管重建的主要方式有人工气管移植、同种异体气管移植和组织工程气管移植等[4]。人工气管移植术后通常会引起气管组织的断裂、感染、狭窄，更因其无上皮细胞层而引起移植的失败[5]；同种异体气管移植后需要长期的免疫抑制治疗，且由于缺乏血管再生能力，其移植物的坏死和感染常导致术后患者的死亡[6]。近年来，组织工程气管的研究得到了学者们的青睐。
各种原因导致的组织或器官缺损及功能障碍是危害人类健康，甚至是导致患者死亡的主要病因。医学领域面临着组织、器官缺损的修复和功能重建的巨大挑战。组织工程学的建立和发展改变了传统的"以创伤修复创伤"的组织移植治疗模式[7]，通过将自体细胞结合生物支架形成工程化组织后再植入体内，从而修复相关组织缺损进行器官重建[8]，此组织再生模式可以真正意义上实现组织器官的再生及功能重建。气管由14~17个"C"字形的气管软骨以及连接各环之间的平滑肌和结缔组织构成，气管后壁缺口由纤维组织膜封闭，气管黏膜富含腺体。气管软骨环具有支撑作用，能够维持气管的形态，保持管腔通畅；气管黏膜由假复层纤毛柱状上皮细胞组成，具有分泌功能，且纤毛摆动能将分泌物排出，保持呼吸道清洁。因此气管重建的支架不仅需要有合适的外形和强度来维持其管腔轮廓，更需要为呼吸上皮和血管的重建提供环境支持[9]。继2008年6月世界上第1例组织工程气管移植成功后[10]，组织工程气管被认为是一种为有效避免供体资源稀缺及免疫排斥反应等缺陷而创建的功能气管替代物，且具有良好的生物相容性及体内生长潜能。Elliott等[11]为1例10岁气管患儿进行组织工程气管移植后进行了2年的随访研究，结果证实了组织工程气管的有效性。然而Hamilton等[12]认为2年的随访结果仍然存在一些未解决的关键问题：①患者气管在成人期之前会继续生长，而移植的组织工程气管是否还具有生长性。②上皮细胞的再生性及对免疫系统长期影响的未知性。③生活质量的评估和医疗保健制度等问题。他们在4年后又做了随访评估，通过CT扫描、内窥镜检查、活检后苏森精-伊红染色等方式进一步证实了组织工程气管的可行性。临床医学的成功移植激励了科研人员不断地探索原位组织再生的潜在机制[13]。
目前组织工程气管的研究热点主要集中在3个方面：①支架材料。②种子细胞。③细胞因子。支架的主要作用是提供细胞生长的空间，易于细胞黏附。用于组织工程气管的支架材料应具有良好的生物降解性和生物相容性，且不会引起免疫排斥反应[14]。脱细胞气管支架、电纺支架因其生物相容性和机械性能的下降已慢慢淡出组织工程；高分子聚合物如聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及两者的共聚物（poly lactic-co-glycolic acid, PLGA）也存在易塌陷及移植后酸性产物蓄积等缺点；而随着3D打印技术的广泛应用，聚已内酯（polycaprolactone, PCL）材料进入了学者们的视线。种子细胞有助于组织工程气管的软骨化和上皮化，其主要包括软骨细胞、上皮细胞、胚胎干细胞以及间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）。细胞因子的主要作用是促进细胞的生长与分化，诱导血管的新生。转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）可以促进软骨细胞分化，重组的血管内皮生长因子（VEGF）或碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）是常用的血管生长因子，促红细胞生成素（EPO）可以通过抑制细胞凋亡来促进伤口愈合及血管再生[15]。目前，学者们研究组织工程气管先选择合适的支架材料，再种植理想的种子细胞及细胞因子，最后进行原位移植。因而寻找合适的种子细胞显得尤为重要。
种子细胞是组织工程气管的重要部分，学者们在不断研究、探索。软骨细胞有助于维持组织工程气管的机械性能，从而防止气管支架塌陷[16]，其主要来源于耳、鼻中隔、肩关节、气管和肋软骨等处，但是获取较难、数量较少、体外培养难及增殖能力低等缺点限制了软骨细胞的应用。Kalathur等[17]研究结果发现，在气管支架表面种植MSCs后可以分化为软骨细胞。上皮细胞具有吸附和活化炎症细胞、清除吸入颗粒物与分泌物等多重功能，从而增强气管的抵御能力，减少感染的风险。其主要来源于鼻、气管及支气管黏膜等处。因上皮细胞再生困难，且在培养与传代过程中会导致其分泌能力下降、纤毛数量减少、防御功能丧失[18]等原因成为组织工程应用中的难题。Jungebluth和Macchiarini[19]也成功利用MSCs培养分化成上皮细胞。胚胎干细胞是从着床前胚胎的内细胞团干或桑椹胚中分离所得的一种高度未分化的细胞[20]，具有较强的增殖能力与全能的分化性能，但提纯与伦理问题成为其在组织工程应用中的瓶颈。相比之下，MSCs来源广泛，取材方便，易于培养，具有较强的增殖再生与多重分化能力，且避免了伦理道德问题，是组织工程理想的细胞来源。
MSCs可从多种器官或组织中分离，如脐带、骨髓、脂肪组织、心肌组织、大脑、肌肉和皮肤等[21]。MSCs可以分泌多种生长因子、细胞因子及趋化因子，甚至可以分泌出细胞外基质，因而具有抗炎、免疫调节和极强的再生能力[22]。MSCs一个最为显著的特性是具有自我更新能力，此特性使其在相当长时间内能产生与自身完全相同的细胞，甚至是在组织或器官的整个生命期[23]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）具有很强的可塑性，可以分化成内胚层、中胚层和外胚层细胞[24]。如在体内外其可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞和肝细胞等。值得肯定的是，随着培养扩增过程中传代次数的增加，其向软骨细胞分化的潜能几乎没什么改变[25]，对组织工程气管有很好的应用价值。
气管重建后最大的并发症是肉芽组织形成后造成的气管狭窄，其是由较差的上皮化导致的。事实上，上皮细胞迁移、增殖能力的缺失经常导致气管移植重建的失败，而MSCs有助于提高上皮细胞形成的能力。在气-液交界条件下，上皮细胞保持着分化能力，并且可以分泌黏蛋白。Le Visage等[26]将MSCs和人支气管上皮细胞共培养后发现，在只有人支气管上皮细胞的体系中，顶端分泌在第21天达到了最大值；而在与MSCs共培养的体系中，在第18和25天仍然保持着稳定的分泌，随后形态学、组织学和功能特征的表达都证实了MSCs的确有助于上皮细胞的成熟、分化与重建。
Batioglu-Karaaltin等[27]将脂肪组织来源的MSCs种植于脱细胞气管基质，用于体内组织工程气管重建的实验。他们从3只兔中分离出1.8 cm长度的气管，进行脱细胞处理使其无免疫原性作为对照组；另外3只兔中分离出的气管脱细胞处理后，在基质表面种植MSCs作为实验组。结果发现：对照组兔存活时间为（17±2）d，且死因主要为气管阻塞和感染；而实验组兔可存活较长时间，且分别在第30、60、90天后处死。随后的组织病理学研究显示，MSCs种植的脱细胞气管和原生气管融合且有血管再生；荧光显微镜下观察，又证实了种植的MSCs的软骨化及促进上皮细胞的再生。可见，MSCs对于组织工程气管是一种可用的重要资源。Liu等[28]将BMSCs集落和可水解的PLGA构建了用于组织工程气管的软骨移植物。其利用了MSCs可定向分化为软骨细胞的特性，将其包裹在PLGA表面形成管状复合物，在培养基中培育4周，并加入TGF-β促其诱导，最后通过组织学和PCR观察证实了移植物的有效性，为组织工程气管移植物提供了新思路。Shin等[1]也将MSCs与猪软骨支架（PCP）共培养后用于气管缺损的修复。其首先将猪关节软骨搅碎后脱细胞处理，放入高5 mm，直径12 mm的支架中；随后抽取幼兔的BMSCs，与PCP支架共培养。培养7周后，将此气管移植物用于6只5 mm×10 mm气管缺陷的兔，分别在术后6周和10周进行观察：6只实验兔未出现任何的呼吸窘迫症状；内窥镜检查显示再生气管处有明显的上皮细胞覆盖，无塌陷或阻塞；纤毛摆动频率测试结果证实再生的上皮细胞与正常细胞无异；CT下显示出气管移植物与原生气管融合良好，连续性完整；进一步的组织学检查结果表明软骨重建成功。可见，MSCs培养下的PCP支架不仅保证了气管所需的形态要求，更是在无免疫排斥反应下保证了气管所需的功能。
2009年，美国材料与试验协会（ASTM）成立了3D打印技术委员会（F42委员会），并公布了3D打印的定义，其是一种与传统材料去除加工方法相反的，基于三维数字模型的，通常采用逐层制造方式将材料结合起来的工艺[29]。这些系统建立在X、Y、Z基础的三维空间，从而实现对加入材料的逐层打印形成3D结构。打印的产品模型主要由计算机辅助设计（computer aided design，CAD）或通过CT成像技术来实现，然后根据个性需求调整参数，传送至3D打印机[30]。3D打印技术仿生制造的器官、组织具有较好的生物力学特性和较高的细胞相容性，弥补了传统组织工程的不足。
Steffens等[31]使用3D打印技术制造出PCL支架，与MSCs共培养后通过电子显微镜扫描、共聚焦显微镜观察两者的相互作用，并用细胞增殖试剂WST-8测定细胞增殖活性。由于传统的2D支架表面积更大，更利于细胞黏附，3D打印支架细胞存活率较低，但是其能更好地观察细胞间的相互作用，而且能够提高组织/细胞的再生时间，更有效地保障组织工程气管的修复。Chang等[9]利用3D打印的PCL支架成功进行了兔气管的重建。他们在兔股骨和胫骨处获得BMSCs，细胞培养后离心处理，随后用含有人纤维蛋白原的溶液重悬，让BMSCs接种于纤维蛋白内，再将支架补片移植于兔气管缺陷处。实验结果发现，细胞存活率达到83.6%，兔气管缺陷处在术后4周和8周均成功重建，3D打印的气管支架与正常气管融合良好，并且重建气管部位覆盖的纤毛呼吸上皮与正常无异。MSCs与3D打印技术的结合有望解决传统组织工程气管重建的问题。
间充质干细胞（MSCs）增殖能力强、分化范围广、易于分离和扩增，更因其具有组织修复及免疫调节等功能，成为了组织工程气管良好的细胞来源，有望广泛应用于临床治疗。目前，MSCs已在骨或软骨损伤[32,33,34]、心脏疾病[35]、肝损伤[36]等方面有所突破。但MSCs要得到广泛运用亦存在不小的挑战与问题：①MSCs在培养扩增中，其增殖和分化的潜能不断降低，因而需要寻找更理想的诱导因子，提高诱导效率。②MSCs定向分化的机制尚未完全明确，其分化过程中是否会引起细胞遗传性状的改变及基因突变，如何确定组织工程气管所需的细胞是由MSCs分化而来，因而需要更稳定、有效地对细胞的分化进行追踪示意。③需要提高植入气管/支架对MSCs的黏附能力，尽可能提高MSCs的存活率；而血管再生化问题的解决，更需要对MSCs进行进一步研究。相信在不久的将来，随着对MSCs特性的不断探索，随着3D打印技术的崛起与对组织工程气管的补充，这些方法必将运用到人类疾病的治疗中。
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