段恬筱; 吴长艳; 胡婷; 胡倩; 张琦; 李晓之; 简文; 罗鹏

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-4255.2020.01.002

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活性氧-线粒体途径在亚砷酸钠诱导L-02细胞凋亡中的作用

中华地方病学杂志, 2020,39(1) : 4-9. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-4255.2020.01.002

摘要

目的

探讨亚砷酸钠（NaAsO₂）通过活性氧（ROS）蓄积及线粒体损伤诱导人肝细胞L-02凋亡的作用，为砷中毒的作用机制研究提供实验依据。

方法

体外培养L-02细胞，分为对照组、NaAsO₂组（10 μmol/L NaAsO₂）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）组（5 mmol/L NAC）、NaAsO₂ + NAC组（10 μmol/L NaAsO₂、5 mmol/L NAC），培养24 h。分别用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针法、JC-1染色法、硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染法检测细胞内ROS水平、线粒体膜电位去极化比例和细胞凋亡率；用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）、细胞色素C蛋白（Cyt-C）、线粒体DNA编码的细胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）mRNA、蛋白表达水平。

结果

各组间细胞内ROS水平（3 857 392.33 ± 44 928.39、4 515 288.00 ± 32 660.64、3 670 150.67 ± 101 987.69、4 035 235.67 ± 99 995.30），线粒体膜电位去极化比例（2.16 ± 0.54、7.95 ± 0.52、2.70 ± 0.29、1.01 ± 0.23），细胞总凋亡率（1.45 ± 0.03、4.27 ± 0.17、1.87 ± 0.12、2.52 ± 0.35）比较差异有统计学意义（F = 62.62、159.81、112.70，P均< 0.05）；各组间Caspase3、Cyt-C、COXⅣ mRNA表达水平比较差异有统计学意义（F = 9.20、7.33、14.87，P均< 0.05）；各组间活化Caspase3（cleaved-Caspase3）、Cyt-C、COXⅣ蛋白表达水平比较差异有统计学意义（F = 31.42、8.01、83.30，P均< 0.05）。与对照组比较，NaAsO₂组L-02细胞内ROS水平、线粒体膜电位去极化比例、细胞总凋亡率明显增高（P均< 0.05）；Caspase3、Cyt-C mRNA和cleaved-Caspase3、Cyt-C蛋白表达水平明显增高（P均< 0.05），COXⅣ mRNA和蛋白表达水平则显著降低（P均< 0.05）。与NaAsO₂组比较，NaAsO₂ + NAC组细胞内ROS水平、线粒体膜电位去极化比例、细胞总凋亡率明显下降（P均< 0.05）；Caspase3 mRNA和cleaved-Caspase3蛋白表达水平明显降低（P均< 0.05），Cyt-C mRNA和蛋白表达水平明显降低（P均< 0.05），COXⅣ mRNA和蛋白表达水平明显增高（P均< 0.05）。

结论

NaAsO₂可刺激L-02细胞产生大量ROS，诱发线粒体去极化，引发线粒体损伤，使Cyt-C向线粒体外释放增加，激活线粒体凋亡途径Caspase3蛋白酶而引起L-02细胞发生凋亡，这有可能是砷致肝损伤的主要作用机制之一。

引用本文: 段恬筱, 吴长艳, 胡婷, 等. 活性氧-线粒体途径在亚砷酸钠诱导L-02细胞凋亡中的作用 [J] . 中华地方病学杂志, 2020, 39(1) : 4-9. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-4255.2020.01.002.

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砷是一种类金属毒素，广泛存在于土壤、岩石和水中^[1]。慢性砷暴露是全球性公共卫生问题，严重危害人类健康^[2,3]。砷可导致皮肤、肝脏、肾脏等多器官、多系统损伤^[4]。流行病学研究表明，肝脏是砷毒性重要的靶器官之一^[5]，慢性砷暴露可导致肝纤维化、肝硬化和肝癌^[6,7]。研究发现，砷可通过氧化应激、DNA损伤、酶活性的改变、细胞凋亡等作用机制引起肝损伤^[8]。本课题组前期研究发现，砷可以引起细胞内活性氧（ROS）水平增高和细胞凋亡增加^[9]，但其作用机制尚不清楚。ROS稳态对于维持正常细胞功能至关重要，ROS产生增加或者ROS清除能力下降导致的氧化-抗氧化平衡的破坏都会导致与许多疾病相关的氧化应激^[10]。ROS主要在线粒体中产生，可以增加细胞内钙水平并影响线粒体功能^[11]。此外，慢性砷暴露会对线粒体造成严重的结构和功能损伤^[12]。基于此，本研究探讨细胞内ROS水平和线粒体损伤在亚砷酸钠（NaAsO₂）引起肝细胞凋亡过程中的作用，明确NaAsO₂是否通过活性氧-线粒体途径诱导L-02细胞发生凋亡，为进一步深入研究砷中毒肝损伤的作用机制提供实验依据。

贡献者信息

段恬筱

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025

吴长艳

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025

胡婷

贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳　550025

胡倩

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025

张琦

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025

李晓之

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025

简文

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025

罗鹏

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025；贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳　550025

通信作者

罗鹏

贵州医科大学公共卫生学院，贵阳　550025；贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室，贵阳　550025

Email：luopeng@gmc.edu.cn

关键词

砷剂; 活性氧; 线粒体; 凋亡; L-02细胞;

基金项目

国家自然科学基金（81660835、81860560）

贵州省区域内一流学科建设项目-公共卫生与预防医学（黔教科研发[2017]85号）

贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY字[2018]188号）

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2020-01-20

收稿日期：2019-08-08

本文编辑

李颖

Original Article

Role of reactive oxygen species-mitochondrial pathway in sodium arsenite-induced apoptosis of L-02 cells

Duan Tianxiao, Wu Changyan, Hu Ting, Hu Qian, Zhang Qi, Li Xiaozhi, Jian Wen, Luo Peng

Published 2020-01-20

Cite as Chin J Endemiol, 2020, 39(1): 4-9. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-4255.2020.01.002

Abstract

Objective

To explore the mechanism of apoptosis induced by sodium arsenite (NaAsO₂) in human hepatic cells (L-02) through reactive oxygen species (ROS) accumulation and mitochondrial dysfunction, and provide experimental evidence for the mechanism of arsenic poisoning.

Methods

L-02 cells were divided into control group, NaAsO₂ group (10 μmol/L NaAsO ₂), N-acetylcysteine (NAC) group (5 mmol/L NAC), and NaAsO₂ + NAC group (10 μmol/L NaAsO ₂, 5 mmol/L NAC), and were cultured in vitro for 24 h. The intracellular ROS level, mitochondrial membrane potential depolarization ratio and cell apoptosis rate were measured by dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) fluorescence probe, JC-1 staining and Annexin V-FITC/PI double staining, respectively; the mRNA and the protein of Caspase 3, cytochrome C (Cyt-C) and cytochrome C oxidaseⅣ (COXⅣ) were detected by real time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) and Western blotting, respectively.

Results

There were statistically significant differences in intracellular ROS levels (3 857 392.33 ± 44 928.39, 4 515 288.00 ± 32 660.64, 3 670 150.67 ± 101 987.69, 4 035 235.67 ± 99 995.30), mitochondrial membrane potential depolarization ratios (2.16 ± 0.54, 7.95 ± 0.52, 2.70 ± 0.29, 1.01 ± 0.23) and total apoptosis rates (1.45 ± 0.03, 4.27 ± 0.17, 1.87 ± 0.12, 2.52 ± 0.35) between groups (F = 62.62, 159.81, 112.70, P < 0.05). There were statistically significant differences in Caspase 3, Cyt-C, COXⅣ mRNA expression levels ( F = 9.20, 7.33, 14.87, P < 0.05) and in cleaved-Caspase 3, Cyt-C, COXⅣ protein expression levels( F = 31.42, 8.01, 83.30, P < 0.05) between groups. Compared with the control group, the intracellular ROS level, mitochondrial membrane potential depolarization ratio and total apoptosis rate were significantly increased ( P < 0.05); Caspase3, Cyt-C mRNA and protein expression levels were significantly increased ( P < 0.05), and COXⅣ mRNA and cleaved-Caspase 3, Cyt-C protein expression levels were significantly decreased ( P < 0.05) in NaAsO ₂ group. Compared with the NaAsO₂ group, the intracellular ROS level, mitochondrial membrane potential depolarization ratio and total apoptosis rate of NaAsO₂ + NAC group were significantly decreased (P < 0.05); the Caspase3, Cyt-C mRNA and cleaved-Caspase 3, Cyt-C protein expression levels were significantly decreased ( P < 0.05), the COX Ⅳ mRNA and protein expression levels were significantly increased ( P < 0.05).

Conclusions

NaAsO₂ stimulates L-02 cells to produce excessive ROS, which induces mitochondrial depolarization and further triggers mitochondrial damage, resulting in increased release of Cyt-C and activation of the mitochondrial apoptosis pathway that Caspase 3 protein induces apoptosis in L-02 cells, which may be one of the main mechanisms of arsenic-induced liver injury.

Key words:

Arsenicals; Reactive oxygen species; Mitochondria; Apoptosis; L-02 cell

Contributor Information

Duan Tianxiao