田国忠

doi:10.3760/cma.j.cn231583-20220315-00079

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检测orfA基因拷贝数鉴定布鲁氏菌种型的实时荧光定量PCR方法研究

田国忠

中华地方病学杂志, 2023,42(5) : 409-413. DOI: 10.3760/cma.j.cn231583-20220315-00079

摘要

目的

建立实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌基因组内IS711转座酶基因（orfA基因）的拷贝数，并应用于布鲁氏菌种与生物型的鉴定。

方法

构建基于Taqman探针法实时荧光定量PCR技术的orfA基因拷贝数的检测体系。设计bcsp31基因和orfA基因的引物和探针，应用实时荧光定量PCR方法同时检测同一菌株相同DNA浓度下的bcsp31基因和orfA基因含量，获得2个基因的循环数（CT值），再根据bcsp31基因和orfA基因CT值的差异，换算出待检测布鲁氏菌菌株基因组内orfA基因的拷贝数。同时，将布鲁氏菌16M菌株DNA进行2倍递减稀释，验证检测体系的稳定性。

结果

当16M菌株DNA浓度相差2倍时，实时荧光定量PCR方法同时检测bcsp31基因和orfA基因，测得的CT值差值均值均为1.00，95%置信区间为0.95~1.05，标准差为0.17，变异系数为0.17。应用该检测体系检测30株布鲁氏菌菌株DNA中orfA基因的拷贝数，发现羊种生物1~3型菌株分别有6、9和7个拷贝数；猪种生物2型菌株有10个拷贝数，与其他4个猪种生物型（1、3~5）菌株拷贝数不同；绵羊附睾种菌株有37个拷贝数；8个牛种生物型（1~7、9）菌株拷贝数稳定在5~6个。

结论

成功建立了一种检测布鲁氏菌orfA基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法，该方法能够鉴定部分布鲁氏菌种与生物型菌株。

引用本文: 田国忠. 检测orfA基因拷贝数鉴定布鲁氏菌种型的实时荧光定量PCR方法研究 [J] . 中华地方病学杂志, 2023, 42(5) : 409-413. DOI: 10.3760/cma.j.cn231583-20220315-00079.

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布鲁氏菌科包括苍白杆菌属和布鲁氏菌属等^[1,2]。依据布鲁氏菌菌株的表型特征和系统发育关系，目前确认的布鲁氏菌属包括12个种：牛种布鲁氏菌（Brucella abortus）、羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、猪种布鲁氏菌（Brucella suis）、犬种布鲁氏菌（Brucella canis）、绵羊附睾种布鲁氏菌（Brucella ovis）、沙林鼠种布鲁氏菌（Brucella neotomae）、Brucella papionis、Brucella ceti、Brucella pinnipedialis、Brucella microti、Brucella inopinata、Brucella vulpis^[1,2]。布鲁氏菌生物学鉴定试验包括菌株生长CO₂需求试验、硫化氢产生试验、噬菌体裂解试验、硫堇和碱性复红染料抑菌试验，以及单项特异性血清（A、M和R血清）凝集试验等^[3]。生物学鉴定试验操作复杂、耗时，并且需要在三级生物实验室进行。而PCR技术以其安全、快速、灵敏度高和特异性强等特点，广泛应用于布鲁氏菌属、种与生物型的鉴定，其中以bcsp31基因为目标基因设计的布鲁氏菌属PCR鉴定方法最为经典^[4]。布鲁氏菌种与生物型的鉴定主要有AMOS-PCR方法^[5]、多重PCR方法^[6]和多位点串联重复序列分析方法（MLVA）^[7]。IS711插入序列是布鲁氏菌特有的核苷酸序列，Southern印迹杂交技术是检测IS711插入序列拷贝数最好的方法^[8]，但是其需要的DNA量较大，且费时费力，无法满足现代检测体系高通量的要求。本研究基于Taqman探针法实时荧光定量PCR技术，设计一种快速、特异、简便和低费用的IS711转座酶基因（orfA基因）拷贝数检测体系，并应用于布鲁氏菌的种与生物型鉴定。

1　材料与方法

1.1　实验菌株和菌株DNA：

实验菌株包括30株布鲁氏菌菌株（其中有27株布鲁氏菌参考菌株、3株临床分离菌株）和8株非布鲁氏菌菌株。参考菌株包括6个种19个生物型的19株菌（牛种8个生物型，猪种5个生物型，羊种3个生物型，以及绵羊附睾种、犬种和沙林鼠种各1个生物型），6株疫苗株和2株粗糙型菌株；临床分离菌株包括1株猪种生物3型菌株（10062）和2株羊种生物2型菌株（79054和17021）。其他非布鲁氏菌菌株包括钩端螺旋体、血清型O∶9小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、血清型O∶157大肠埃希菌、结核分枝杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、炭疽芽孢杆菌和伤寒沙门菌。30株布鲁氏菌菌株DNA和8株非布鲁氏菌菌株DNA来源于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，- 80 ℃冰箱保存。

1.2　主要仪器与试剂：

DNA微量分光光度测定仪（Spectrophotometer NanoDrop 1000，美国NanoDrop公司），实时荧光定量PCR仪（LightCycler 4800Ⅱ，美国Roche公司）。荧光定量PCR反应酶复合物Premix Ex Taq^TM（Probe qPCR，日本TaKaRa公司）。

1.3　实时荧光定量PCR引物和探针：

bcsp31基因的引物和探针序列参照文献[9]，正向引物B-F：5'-GCTCGGTTGCCAATATCAATGC-3'，反向引物B-R：5'-GGGTAAAGCGTCGCCAGAAG-3'，探针B-Probe：5'-AAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCA-3′，其中5'端用荧光基团FAM标记，3'端用淬灭基团BHQ-1标记。orfA基因的引物和探针，依据orfA基因核苷酸序列，采用DNAstar（版本V8.1.3）软件进行设计，正向引物O-F：5'-AACAGCATGCAGCTTGGTCGTC-3'，反向引物O-R：5'-ACCATATCGAAAGTCCACGCAG AT-3'，探针O-Probe：5'-TCCACCGCGCGAGCGACC GATGC-3'，其中5'端用荧光基团HEX标记，3'端用淬灭基团BHQ-1标记。引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4　实时荧光定量PCR反应体系和反应条件：

将-80 ℃冰箱保存的30株布鲁氏菌菌株DNA和8株非布鲁氏菌菌株DNA取出，采用DNA微量分光光度测定仪测定DNA浓度，使用双蒸水将菌株DNA浓度均稀释为0.1 ng/μl，以供本实验使用。实时荧光定量PCR反应体系：酶复合物Premix Ex Taq^TM 10.0 μl，正向引物、反向引物和探针（10 μmol/L）各0.4 μl，DNA模板2.0 μl，补充双蒸水至20.0 μl。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，40个循环，在退火阶段检测荧光信号以及循环数（CT值），平行测定4次。bcsp31基因和orfA基因实时荧光定量PCR方法检测的反应体系和反应条件相同。使用实时荧光定量PCR仪进行数据分析，计算CT值的平均值及标准差和标准误。

1.5　方法验证：

①特异性试验：以非布鲁氏菌菌株DNA为模板，应用实时荧光定量PCR方法检测orfA基因和bcsp31基因。②稳定性试验：测定布鲁氏菌16M菌株DNA浓度，并进行2倍递减稀释，以稀释后的菌株DNA为模板，应用实时荧光定量PCR方法检测orfA基因和bcsp31基因。③浓度差值、CT值与拷贝数换算：操作同稳定性试验，4次平行测定后，将测得的CT值进行DNA浓度、拷贝数关系换算，获得拷贝数与CT值的换算公式，计算orfA基因拷贝数。同时自NCBI网站查找已公布布鲁氏菌全基因组内染色体Ⅰ和Ⅱ合计的orfA基因拷贝数（全基因组测序），与本研究结果进行比较。

1.6　统计分析：

采用Excel 2017软件进行数据的处理与分析。

2　结果

2.1　实时荧光定量PCR方法特异性试验：

基于orfA基因和bcsp31基因，应用实时荧光定量PCR方法同时检测钩端螺旋体、血清型O∶9小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、血清型O ∶ 157大肠埃希菌、结核分枝杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、炭疽芽孢杆菌和伤寒沙门菌共8种细菌DNA，均未检出特异荧光曲线（无CT值）。

2.2　实时荧光定量PCR方法稳定性试验：

布鲁氏菌16M菌株DNA的初始浓度为56.2 ng/μl，当DNA浓度相差2倍时，测得的CT值差值均值均为1.00，95%置信区间为0.95~1.05，标准差为0.17，变异系数为0.17。并且，在检测的30株布鲁氏菌菌株中，bcsp31基因CT值的总体标准差为0.04，标准误为0.02。

2.3　菌株DNA浓度差值与实时荧光定量PCR方法测得CT值及基因拷贝数的关系：

布鲁氏菌16M菌株DNA 2倍递减稀释后，经过4次平行测定，获得了拷贝数与CT值的换算公式：n = ROUNDDOWN（POWER（2，（CT_bcsp31 - CT_orfA）/1）），其中，n为orfA基因拷贝数，ROUNDDOWN为取整数，POWER为乘幂，CT_bcsp31 - CT_orfA为实时荧光定量PCR方法分别检测同一菌株同一浓度DNA的bcsp31基因和orfA基因CT值的差值，1为系数。

2.4　布鲁氏菌菌株orfA基因的拷贝数检测结果：

应用实时荧光定量PCR方法同时检测同一菌株同一浓度DNA的两个基因（bcsp31和orfA），每一菌株进行4次平行测定，获得CT值均值，按照公式n = ROUNDDOWN（POWER（2，（CT_bcsp31 - CT_orfA）/1））进行orfA基因的拷贝数换算，结果见表1。不同种与生物型的布鲁氏菌具有独特的orfA基因拷贝数，其中具有种与生物型区别的是羊种生物2型菌株，具有9个拷贝数，可与羊种生物1型（6个拷贝数）和3型菌株（7个拷贝数）鉴别；猪种生物2型菌株具有10个拷贝数，能够与其他4个猪种生物型菌株鉴别；绵羊附睾种菌株具有37个拷贝数；8个牛种生物型菌株拷贝数稳定在5~6个。同时，实时荧光定量PCR方法检测结果与全基因组测序结果比较，稳定性较好。见表2。

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表1

实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌bcsp31基因和orfA基因的循环数（CT值）与拷贝数关系表

表1

实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌bcsp31基因和orfA基因的循环数（CT值）与拷贝数关系表

菌株编号	菌株名称	种与生物型	bcsp31基因		orfA基因		CT值差值^c	orfA基因拷贝数^d
菌株编号	菌株名称	种与生物型	CT值均值^a	CT值标准差^b	CT值均值^a	CT值标准差^b	CT值差值^c	orfA基因拷贝数^d
1	544A	牛种生物1型	26.63	0.03	24.06	0.09	2.57	6
2	86/8/59	牛种生物2型	26.55	0.03	24.17	0.02	2.38	5
3	Tulya	牛种生物3型	26.67	0.09	24.41	0.05	2.26	5
4	292	牛种生物4型	27.13	0.06	24.53	0.05	2.60	6
5	B3196	牛种生物5型	27.17	0.03	24.79	0.03	2.38	5
6	870	牛种生物6型	26.40	0.07	23.71	0.02	2.69	6
7	63/75	牛种生物7型	26.31	0.03	23.60	0.02	2.71	6
8	C68	牛种生物9型	26.40	0.07	23.98	0.06	2.42	5
9	16M	羊种生物1型	27.18	0.03	24.52	0.02	2.66	6
10	63/9	羊种生物2型	27.56	0.03	24.43	0.04	3.13	9
11	Ether	羊种生物3型	27.67	0.05	24.79	0.08	2.88	7
12	1330S	猪种生物1型	26.79	0.05	24.15	0.05	2.64	6
13	Thomson	猪种生物2型	27.14	0.05	23.84	0.05	3.30	10
14	686	猪种生物3型	27.07	0.07	24.37	0.07	2.70	6
15	40	猪种生物4型	26.31	0.03	24.13	0.07	2.18	5
16	513	猪种生物5型	25.13	0.01	22.42	0.07	2.71	6
17	RM6/66	犬种	27.01	0.05	24.03	0.06	2.98	8
18	63/290	绵羊附睾种	27.14	0.05	21.94	0.05	5.20	37
19	5K33	沙林鼠种	26.69	0.04	24.10	0.04	2.59	6
20	M5	羊种疫苗株	25.78	0.03	22.92	0.01	2.86	7
21	M28	羊种疫苗株	26.92	0.02	24.07	0.03	2.85	7
22	REV1	羊种疫苗株	27.15	0.05	24.74	0.05	2.41	5
23	A19	牛种疫苗株	25.84	0.02	23.32	0.02	2.52	6
24	104M	牛种疫苗株	26.05	0.04	23.52	0.01	2.53	6
25	S2	猪种疫苗株	25.84	0.01	22.96	0.02	2.88	7
26	45/20	牛种粗糙型	27.38	0.02	24.71	0.02	2.67	6
27	B115	羊种粗糙型	25.88	0.04	23.27	0.01	2.61	6
28	10062	猪种生物3型	27.44	0.04	24.95	0.06	2.49	6
29	79054	羊种生物2型	25.91	0.05	22.89	0.05	3.02	8
30	17021	羊种生物2型	27.06	0.06	24.07	0.05	2.99	8

注：^a4次平行测定获得的CT值均值；^b4次平行测定获得的CT值标准差；^c实时荧光定量PCR方法检测bcsp31基因和orfA基因CT值的差值；^d根据拷贝数与CT值的换算公式计算得出；28~30号菌株为临床分离菌株

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表2

实时荧光定量PCR方法检测实验菌株orfA基因拷贝数与全基因组测序菌株orfA基因拷贝数的比较

表2

实时荧光定量PCR方法检测实验菌株orfA基因拷贝数与全基因组测序菌株orfA基因拷贝数的比较

菌株名称	实验菌株			对照菌株
菌株名称	种与生物型	CT值^a	orfA基因拷贝数^b	orfA基因拷贝数^c	染色体Ⅰ	染色体Ⅱ
544A	牛种生物1型	2.57	6	6（A13334）	CP003176.1	CP003177.1
86/8/59	牛种生物2型	2.38	5	6	NZ_CP007765.1	CP007764.1
Tulya	牛种生物3型	2.26	5	-	-	-
292	牛种生物4型	2.60	6	-	-	-
B3196	牛种生物5型	2.38	5	-	-	-
870	牛种生物6型	2.69	6	5	NZ_CP007709.1	NZ_CP007710.1
63/75	牛种生物7型	2.71	6	-	-	-
C68	牛种生物9型	2.42	5	5	NZ_CP007705.1	NZ_CP007706.1
16M	羊种生物1型	2.66	6	6	CP007763.1	CP007762.1
63/9	羊种生物2型	3.13	9	10	NZ_CP007789.1	NZ_CP007788.1
Ether	羊种生物3型	2.88	7	6	CP007760.1	CP007761.1
1330S	猪种生物1型	2.64	6	6	NC_004310.3	CP002998.1
Thomson	猪种生物2型	3.30	10	13（23445）	CP000911.1	CP000912.1
686	猪种生物3型	2.70	6	4	NZ_CP007719.1	NZ_CP007718.1
40	猪种生物4型	2.18	5	-	-	-
513	猪种生物5型	2.71	6	-	-	-
RM6/66	犬种	2.98	8	5（52141）	CP003174.1	CP003175.1
63/290	绵羊附睾种	5.20	37	38（25840）	CP000708.1	CP000709.1
5K33	沙林鼠种	2.59	6	-	-	-

注：^a实时荧光定量PCR方法检测bcsp31基因和orfA基因循环数（CT值）的差值；^borfA基因实时荧光定量PCR方法检测获得的拷贝数；^c已公布布鲁氏菌全基因组内染色体Ⅰ和Ⅱ合计的orfA基因拷贝数；括号内为全基因组测序菌株；"-"为无数据

3　讨论

随着病原菌不断被发现与研究，布鲁氏菌的宿主、种与生物型逐渐被更新，其分类与鉴别越来越多样化。国外报道了可以鉴别牛种、羊种、猪种、犬种、绵羊附睾种、沙林鼠种、Brucella ceti（鲸鱼和海豚）、Brucella pinnipedialis（鳍足类）8个种^[10]，以及鉴定猪种5个生物型的多重PCR方法^[11]；目前最常使用的MLVA技术^[7]和多位点序列分型（MLST）技术^[12]同样具有布鲁氏菌种与生物型鉴别能力，但是这些方法难以鉴别犬种与某些猪种生物型菌株，不能区别羊种生物2型和3型菌株。IS711插入序列在布鲁氏菌基因组内具有多个拷贝数^[13]，在分析布鲁氏菌不同种与生物型菌株全基因组DNA时发现，与IS711插入序列密切相关的orfA基因，同样存在着多个拷贝数，与IS711插入序列的拷贝数具有对应的关系。

bcsp31基因在布鲁氏菌菌株中具有属特异性和单拷贝数的特征，而orfA基因具有多个拷贝数。利用这两个基因（bcsp31和orfA）经实时荧光定量PCR方法测得CT值的差值，能够换算出orfA基因的拷贝数，该方法能够区分3个羊种生物型菌株：羊种生物1型菌株有6个拷贝数，羊种生物2型菌株有9个拷贝数，羊种生物3型菌株有7个拷贝数。对于绵羊附睾种菌株，临床分离的菌株很少，目前没有快捷的检测方法对其进行鉴定，实时荧光定量PCR方法发现其orfA基因有37个拷贝数，与其他菌种具有明显差别。猪种生物2型菌株有10个拷贝数，与其他猪种生物型具有明显的区别。

对布鲁氏菌疫苗株而言，牛种疫苗株A19和104M与牛种生物1型菌株orfA基因的拷贝数一致，而猪种疫苗株S2有7个拷贝数，与猪种生物1型菌株（6个拷贝数）有差别；羊种疫苗株M5和M28皆有7个拷贝数，羊种疫苗株REV1有5个拷贝数，而羊种生物1型菌株有6个拷贝数，三者之间可以进行鉴别。

本实验共测试了3株临床分离菌株，其中猪种生物3型菌株1株，其orfA基因的拷贝数与参考菌株（686）完全一致。另外2株羊种生物2型菌株测得的orfA基因有8个拷贝数，而实验室保存的羊种生物2型参考菌株（63/9）有9个拷贝数，全基因组测序羊种生物2型菌株（63/9）有10个拷贝数，三者间的差异是否为传代过程中菌株的基因发生了变化，有待于进一步研究。

由于实验室没有保存Brucella ceti、Brucella pinnipedialis、Brucella microti和Brucella inopinata等其他布鲁氏菌菌种，因此本实验未能测试这些菌种orfA基因的拷贝数，未来将进行相关的研究，以完善所建立的方法。

利益冲突

所有作者声明无利益冲突

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贡献者信息

田国忠

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京　102206

通信作者

田国忠

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京　102206

Email：tianguozhong@icdc.cn

关键词

布鲁杆菌属; orfA基因; 拷贝数; 实时荧光定量PCR;

基金项目

国家重点研发计划项目（2021YFC2600501）

利益冲突

所有作者声明无利益冲突

历史

出版日期：2023-05-20

收稿日期：2022-10-11

本文编辑

麻新影

Method

Detecting the copy number of orfA gene to identify Brucella species and biovars by a real-time quantitative PCR assay

Tian Guozhong

Published 2023-05-20

Cite as Chin J Endemiol, 2023, 42(5): 409-413. DOI: 10.3760/cma.j.cn231583-20220315-00079

Abstract

Objective

To establish a real-time quantitative PCR assay to detect the copy number of IS711 transposase gene (orfA) in Brucella genome, and the assay is applied to identify the species and biovars of Brucella.

Methods

To establish an orfA gene copy number detection system based on Taqman real-time quantitative PCR technique. Primers and probes of bcsp31 and orfA genes were designed, the contents of bcsp31 gene and orfA gene in the same strain with the same DNA concentration were simultaneously detected by real-time quantitative PCR assay, and cycle number (CT value) of the two genes were obtained. According to the differences of CT values of bcsp31 gene and orfA gene, the copy number of orfA gene in Brucella genome was calculated. At the same time, the DNA of Brucella 16M strain was double decreasing dilution to verify the stability of the detection system.

Results

A real-time quantitative PCR assay was used to detect bcsp31 gene and orfA gene simultaneously, when the DNA concentration difference of 16M strain was 2 times, the mean difference of CT values measured was 1.00, 95% confidence interval was 0.95-1.05, standard deviation was 0.17, and coefficient of variation was 0.17. The orfA gene copy number of 30 Brucella strains was detected by this detection system. It was found that there were 6, 9, and 7 copy numbers in the biovars 1-3 of Brucella melitensis, respectively. The strain of Brucella suis biovar 2 had 10 copy numbers, which were different from those of the other 4 strains of biovars 1, 3-5. There were 37 copy numbers in Brucella ovis strain. The copy numbers were stable at 5-6 copies in 8 biovars (1-7, 9) of Brucella abortus strains.

Conclusions

A real-time quantitative PCR assay for detection of orfA gene copy number in Brucella DNA has been established. This method could identify some Brucella species and biovars strains.

Key words:

Brucella; OrfA gene; Copy numbers; Real-time quantitative PCR

Contributor Information

Tian Guozhong

National Institute for Infectious Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

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