雄激素不仅在生殖功能方面起到至关重要的作用，对维持骨骼的生长和保证骨骼的完整性也具有重要意义。传统观点认为骨骼仅仅是接受激素调节的靶器官。然而，近年来的研究发现，骨骼自身也可作为内分泌器官调控睾丸功能。本文将介绍睾丸在骨代谢中的影响以及骨骼对睾丸的反向调节作用，并初步探讨其临床意义。
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骨骼与睾丸之间的信号交流以睾丸间质细胞(Leydig cells)为中心(图1、图2)。睾丸间质细胞除负责合成类固醇和睾酮外，也是保证骨骼健康的基础。它能产生胰岛素样因子3(insulin-like factor 3, INSL3)[1,2]，促进成骨细胞的增殖与分化；也能通过表达CYP2R1酶[3,4]，实现维生素D3的25-羟基化。因此，睾丸功能减退可导致睾酮、INSL3和25-羟维生素D3的水平下降，骨量减少和骨质疏松症的风险增加。同样地，骨骼对睾丸功能的调控也有不容忽视的重要性。成骨细胞产生的骨钙素(OCN)在细胞外基质脱羧转化为低羧化骨钙素(ucOCN)并释放入血，经血液循环到达表达ucOCN受体的靶组织后发挥其内分泌作用。在睾丸中，ucOCN通过结合其特异性受体GPRC6A，刺激睾丸间质细胞引起睾酮分泌，促进精子生成和增加精细胞存活率[5,6]。研究骨骼与睾丸之间的信号交流，有助于对男性性腺功能减退和骨质疏松症生化诊断的探索，启发临床治疗方案的新思路。本文就骨骼与睾丸信号交流的最新进展予以综述。
注：T：睾酮Testosterone；DHT：二氢睾酮Dihydrotestosterone；AR：雄激素受体Androgen receptor；E2：17β-雌二醇17β-estradiol；ER：雌激素受体Estrogen receptor；INSL3：胰岛素样因子3 Insulin-like factor 3；RXFP2：松弛素家族肽2 Relaxin family peptide 2
注：GnRH：促性腺激素释放激素Gonadotropin releasing hormone；LHR：LH受体LH receptor；INS：胰岛素Insulin；INSR：胰岛素受体Insulin receptor；OCN：骨钙素Osteocalcin；ucOCN：低羧化骨钙素Undercarboxylated osteocalcin；GPRC6A：G蛋白耦联受体C类6组A亚型G-protein coupled receptor, class C, group 6, subtype A；cAMP：环磷酸腺苷Cyclic adenosine monophosphate；CREB：环腺苷酸反应元件结合蛋白cAMP responsive element-binding protein；StAR：类固醇急性调节蛋白Steroidogenic acute regulatory protein；Cyp11a：胆固醇侧链裂解酶Cholesterol side-chain cleavage enzyme；3β-HSD：3β-羟类固醇脱氢酶3-β-hydroxysteroid dehydrogenase；Cyp17：17α-羟化酶Cytochrome P450 17α；T：睾酮Testosterone
性激素可引起骨骼生长发育的性别差异。雄激素在男性的骨骼生长发育中发挥至关重要的作用。事实上，男性骨骼的特征是骨骼尺寸更大，骨骼更坚固。在青春期前，骨骼的大小和体积在男性和女性间差别并不显著；从青春期开始，男性和女性的骨骼差别变得显著，主要是因为男性的雄激素促进外骨膜下骨形成，而女性的雌激素则抑制外骨膜下骨形成[7]。这种骨骼生长发育的性别差异性部分解释了男性脆性骨折发生率低于女性[8]。青春期前性腺功能不全引起的雄激素缺乏与青春期的骨密度降低相关，而在骨骺闭合之前使用睾酮可使骨量增加；年轻成年男性中，血清游离睾酮与皮质骨尺寸呈正相关[8]。研究表明，雄激素对女性骨量峰值也有影响，因为女性雄激素过多与较高的骨密度有关[9]。在雄激素不敏感综合征(androgen insensitivity syndrome, AIS)患者中雄激素信号部分或者完全缺失，患者骨密度(特别是腰椎部位)降低，雌激素替代治疗不能完全恢复骨密度[10]。因此，雄激素在骨骼生长发育中发挥不可替代的调控作用。
睾酮是男性最重要的雄激素，95%由睾丸产生，主要通过激活核受体介导的缓慢基因组机制和膜受体介导的快速非基因组机制而发挥作用[11]。睾酮在血液循环中与白蛋白和性激素结合球蛋白(SHBG)结合，也可在外周组织中经5α-还原酶不可逆地转变为活性更高的二氢睾酮，睾酮和二氢睾酮均能激活雄激素受体(AR)[12](图1)。此外，睾酮也可以被芳香化酶(CYP19)转化为17β-雌二醇(E2)，后者结合并激活雌激素受体α(ERα)或β(ERβ)[11](图1)。文献报道，AR、ERα和ERβ在人类、大鼠和小鼠的成骨细胞、破骨细胞、骨细胞及生长板的软骨细胞中广泛表达[10,13]。
睾酮在男性骨骼的生长发育和代谢中发挥着重要的调控作用，对骨骼生长成熟和维护起着积极作用。骨质疏松症男性患者性腺功能不全的发病率尚不清楚，已经完成的研究很少，涉及的医疗中心和患者数量也较少。有研究表明，由性腺功能减退导致男性继发性骨质疏松症的比率为16%～30%不等[10]。睾酮或二氢睾酮通过AR，不仅能刺激成骨细胞的增殖与分化，减弱其凋亡，有效地刺激骨小梁形成，还能增加成骨细胞骨保护素(OPG)的合成，从而减弱破骨细胞的形成和骨吸收能力[14,15]。睾酮替代治疗(TRT)可促进青春期前性腺功能不全的青少年骨骺闭合，并且会降低性腺功能低下的成年人的骨矿化，预防和逆转骨质疏松[16,17]。2012年美国《男性骨质疏松症临床指南》将睾酮测定作为骨质疏松症诊断的一部分，并且当血清睾酮低于6.9 nmol/L时推荐睾酮替代治疗[18]。研究表明，AR多态性对骨骼的影响也相当重要。AR的1号外显子中CAG重复序列的长度与AR的转录活性降低相关，也与骨量减少和骨质疏松性骨折风险增加有关[19]。在低促性腺激素性性腺功能减退的男性患者中，CAG重复序列较短的患者使用TRT对增加骨密度能起到更好的效果[20]。虽然睾酮水平和AR多态性与骨密度和骨折风险相关，但尚未证明TRT可预防性腺功能减退的男性骨折，特别是晚发性性腺功能减退症的患者。
另外，睾酮对皮质骨的作用部分依赖于芳香化为雌激素(图1)。雌激素能抑制骨细胞凋亡、促进转化生长因子α(TGF-α)产生，TGF-α能抑制破骨细胞性骨吸收[14]。研究表明，携带编码芳香化酶突变基因(雌激素缺乏)或ERα基因突变的男性，会有严重的骨量减少和骨骺不闭合伴血清睾酮正常或升高[7]。予以雌激素补充治疗后，这些患者骨量明显升高[7,14]。以上结果说明，雄激素在骨骼生长发育及骨代谢中不仅能发挥直接的调控作用，也可通过转化为雌激素发挥间接的调控作用。此外，AR和ERα双敲雄性小鼠的研究表明，AR和ERα同时失活比AR或ERα单独破坏的小鼠皮质骨骨量低，AR单独激活仅能维持松质骨的发育，AR和ERα同时激活才能保证皮质骨的大量保留[21](图1)。总而言之，在男性中，睾酮不仅可以直接作用于骨骼，也可以通过芳香化酶转化为雌激素在骨骼生长发育及骨代谢中发挥间接调控作用，芳香酶缺乏或者药物阻断芳香酶可以导致骨量降低。
睾丸间质细胞的内分泌功能不完全依赖于睾酮的产生，INSL3是由睾丸间质细胞分泌的另一种特异性激素，也可作用于成骨细胞[22]。在男性的生命历程中，血清中INSL3水平随着性腺功能的改变呈现波动性的变化，自青春期开始逐渐升高，至性成熟期达到最高，衰老后性腺功能逐渐减退，血清INSL3水平也逐渐下降[11,23,24,25]。INSL3能刺激成骨细胞基因的表达，进而促进成骨细胞增殖和基质沉积相关蛋白合成，例如碱性磷酸酶(ALP)、COL1A1、COL6A1、骨粘连蛋白、骨桥蛋白和转化生长因子β(TGF-β)[2]。此外，INSL3还通过增加成骨细胞中M-CSF的表达间接刺激破骨细胞生成[2]。
INSL3通过特异性激活G蛋白耦联受体松弛素家族肽2(RXFP2)诱导细胞内cAMP水平的升高，MAP激酶级联反应，激活关键的成骨细胞基因表达，最后刺激骨骼矿化[1,2](图1)。Ferlin等[1]通过分析25名(27～41岁)携带RXFP2基因突变男性的骨密度发现，其中16名(64%)患者伴有低骨量或骨质疏松症，在这些研究对象中，没有其他的导致骨质疏松症病因，他们的睾酮水平和性腺功能也正常，说明RXFP2基因突变使低骨密度风险增加。另外，Rxfp2敲除小鼠(Rxfp2－/－小鼠)也表现出骨量减少和典型的骨小梁脆性改变[1]。INSL3血清浓度下降仅发生在睾丸间质细胞不成熟或异常的个体中，如性腺功能减退的男性[11,22]。在这种情况下，常伴有睾酮水平降低，因此难以辨别INSL3对骨骼改变的贡献率。相比之下，具有RXFP2基因突变的成年男性和雄性小鼠具有正常的睾酮水平[1]，这表明在INSL3对骨代谢的调控是必不可少的，并且不能完全被睾酮代偿。总之，睾丸间质细胞产生INSL3，通过G蛋白耦联受体RXFP2在成骨细胞内激活MAP信号通路，促进成骨细胞分化成熟及骨基质的形成和矿化[2]。相反，RXFP2在人群中的突变将导致骨密度降低、骨质疏松发病率显著增加；另外，Rxfp2－/－小鼠骨量也显著降低。
不论在男性还是女性中，维生素D均是钙稳态和骨矿化的关键调节因子[3]。维生素D必须经过25-羟化酶和1α-羟化酶催化的两次连续的羟化，才能转化为其活性形式的1，25-双羟维生素D3。CYP2R1编码负责维生素D代谢第一步的关键酶[4,26]。在6种不同的P450维生素D 25-羟化酶中，由CYP2R1编码的25-羟化酶是最重要的酶，因CYP2R1突变导致25-羟维生素D3选择性缺乏的患者，将出现钙稳态失衡和佝偻病[4,27]。
在小鼠和人类中，许多组织表达CYP2R1 mRNA，但以睾丸中的表达量最高[28]。通过免疫组化方法，在睾丸间质细胞和精原细胞中检测到CYP2R1的表达；在完全缺乏生殖细胞(只有支持细胞)的睾丸中发现CYP2R1的mRNA表达降低[28,29]。研究显示，15名年轻[年龄(34.8±6.4)岁]男性患者因睾丸癌接受双侧根治性睾丸切除术后予以睾酮替代治疗，在3～5年随访期间25-羟维生素D3浓度较41名年龄相匹配的健康男性明显降低[试验组(30.2±16.3) nmol/L，对照组(74.9±38.0) nmol/L][29]。这一结果表明睾丸发挥约60%的25-羟基化作用[29]，提示任何原因引起的睾丸疾病均可能通过损害25-羟化酶活性而在维生素D缺乏的发病中起作用。充足的1，25-双羟维生素D3，在增强破骨细胞活性的同时，还能增加肠道钙吸收，减少肾脏钙排泄[30](图1)。总之，人类和小鼠实验证明CYP2R1基因在睾丸呈高表达，CYP2R1基因编码的25-羟化酶，是生成活性维生素D3(1，25-双羟维生素D3)的关键酶之一。睾丸的异常病理改变将导致25-羟化酶减少，进而影响骨代谢。
在男性中，睾丸功能主要由下丘脑-垂体-睾丸轴调节。根据该内分泌途径，下丘脑释放促性腺激素释放激素(GnRH)，从而刺激腺垂体产生两种促性腺激素，即FSH和LH。随后，FSH调节支持细胞的精子生成和产物产生，如抑制素B，后者反过来可选择性地抑制垂体FSH的生成。LH主要作用于睾丸间质细胞，刺激睾酮合成，精子的生成有赖于高水平的睾酮。并且，雄激素合成受到由睾酮和雌激素产生的对下丘脑和垂体的反馈调节[6]。
最近的研究表明，骨衍生的激素OCN涉及另一新型的与下丘脑-垂体-睾丸轴相似的通路，即胰腺-骨骼-睾丸轴[5,6]。OCN是一种众所周知的骨形成标志物，是来源于成骨细胞的非胶原蛋白，在骨细胞外基质中高度表达，通过骨吸收释放入血。OCN有羧化和低羧化两种形式[31,32]。胰岛素(INS)通过经典的胰岛素受体(INSR)路径抑制OPG从成骨细胞中释放，进而解除OPG对RANK/RANKL系统的抑制作用，破骨细胞在吸收陷窝通过向细胞外基质泌酸，促进骨重建[6,31]。在发生骨重建的同时，微环境中的pH值下降，有利于OCN脱羧形成有活性的ucOCN，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，在骨细胞外基质和血液中可检测到ucOCN[6]。因此，骨钙素的激活依赖于两种特定骨细胞之间的相互作用：成骨细胞和破骨细胞(图2)。
在睾丸中，睾丸间质细胞通过GPRC6A受体接受ucOCN的信号，产生cAMP，进而激活下游转录因子环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB)，促进编码睾酮合成相关酶的基因StAR、Cyp11a、3β-HSD和Cyp17的表达[32,33,34,35]。其中，类固醇急性调节蛋白(StAR)在类固醇合成起始环节转运胆固醇至线粒体的过程中发挥重要作用；胆固醇侧链裂解酶(Cyp11a)催化胆固醇转化为孕烯醇酮；3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)和17α-羟化酶(Cyp17)是孕烯醇酮转化为睾酮过程中所需的两种酶。经过以上过程，最终促进睾酮的生物合成，睾酮再促进精子产生和精细胞存活[33,36](图2)。另外，胰腺-骨骼-睾丸轴与下丘脑-垂体-睾丸轴一起，引起睾丸间质细胞分泌睾酮和25-羟维生素D3，而ucOCN对睾丸间质细胞产生INSL3的可能作用尚未被研究。
作为OCN的活性形式，ucOCN可促进胰岛β细胞增殖以及胰岛素的产生和分泌(图2)；增加骨骼肌和脂肪组织对胰岛素的敏感性；增加大脑中神经递质的产生和刺激睾丸中睾酮产生[31]。Oury等[33]发现，Ocn敲除雄鼠(Ocn－/－小鼠)的睾丸大小、重量降低，睾酮水平下降，产生精子的数量下降，睾丸中StAR、Cyp11a、3β-HSD、Cyp17的表达降低。另外，当敲除Ocn下游抑制子Esp时，形成骨钙素功能获得型雄性小鼠(ESP－/－小鼠)，其生殖能力与Ocn－/－小鼠变化相反，表现为睾丸、附睾、精囊重量增加，精子数量增加。以上研究结果说明，OCN可促进睾丸间质细胞合成及分泌睾酮，调节雄性小鼠的生殖能力。另外，该课题组进一步分析了成骨细胞中敲除InsR基因的12周龄雄性小鼠(InsRosb－/－小鼠)，结果显示，InsRosb－/－雄性小鼠与Ocn－/－雄性小鼠的生物化学和分子表型相似。这些具有较低ucOCN水平的动物表现出睾丸大小和重量、附睾和精囊重量、精子计数和睾酮水平降低。此外，与Ocn－/－雄性小鼠一样，InsRosb－/－睾丸中StAR、Cyp11a、3β-HSD、Cyp17的表达也降低[5]。这些动物研究结果表明，成骨细胞中的胰岛素信号是骨钙素引起睾酮合成的上游决定因素。另一独立于下丘脑-垂体-睾丸轴的新型内分泌轴，即胰腺-骨骼-睾丸轴也对睾酮的产生有不容忽视的作用。
动物研究已经证实OCN可通过增加睾酮产生和精子数量来影响雄性动物的生殖功能。然而，相关的临床研究很少。在正常人群中，OCN与睾酮的关系如何也不清楚。在56名(骨龄4～20岁)男性中，总睾酮从骨龄11岁开始增加，OCN在骨龄14岁到达最高峰；在骨龄11～14岁组，总骨钙素(tOCN)和ucOCN与总睾酮呈正相关[37]。另一项研究调查了1 338名(25～86岁)健康成年男性，发现tOCN与总睾酮呈正相关[38]。在2 400名(20～69岁)中国成年男性中，血清tOCN与总睾酮水平呈正相关[39]。以上研究结果支持在动物实验的观察。而对614名(69.8～81.2岁)老年男性的研究得到了不同的结果，血清tOCN与总睾酮无相关性，但与游离睾酮和生物活性睾酮呈负相关[40]。因此，目前的研究结果提示，在正常人群中OCN与睾酮的关系可能在某些特殊阶段，如骨骼快速生长期呈正相关关系。
值得一提的是，睾丸功能低下的人群中所观察到的现象并非如此。在159名(31～41岁)年轻不育男性中，精子的数量、精液体积与tOCN、ucOCN没有明显的相关性[41]。另外，在34名(26～52岁)不育男性和20名(27～40岁)正常健康男性的对照研究中发现ucOCN在不育男性中显著增高，但是ucOCN与睾酮、LH、FSH及精子的数量和质量无相关性[42]。因此，在不育病例中，高水平的ucOCN不能作为男性生殖能力的预测指标。但是，在59名(32.2～49.4岁)表现为不育与精子减少、伴LH升高、不伴睾酮升高的原发性睾丸功能低下的男性患者中，检测其OCN和GPRC6A的外显子序列，发现其中2名原发性睾丸功能低下的患者在GPRC6A的4号外显子上出现T→A的错义突变，导致GPRC6A跨膜区域氨基酸改变而难以定位于细胞膜，进而发生骨钙素信号障碍；而在另外942名健康男性对照组中未发现该突变[5]。结果表明，GPRC6A可能是人类原发性睾丸功能低下的易感基因之一。但是，由于测序仅限于外显子，因此不能排除在其他原发性睾丸功能低下的患者中存在骨钙素或GPRC6A调节区域的突变。总之，在一些动物实验和临床研究中，虽然骨钙素和睾酮之间的呈现出正相关关系，但其中关联的机制有待进一步阐明。
综上所述，骨骼和睾丸通过睾酮、INSL3、25-羟化酶和ucOCN形成信号调节网络，分别调控骨代谢和雄性生殖功能。但是，不论是睾丸对骨骼发育和代谢的影响，还是骨骼对睾丸的反向调节作用，目前的研究结果仅提示了正反馈作用，未提及负反馈，难以构成内分泌调节的反馈环路机制。另外，人群研究的样本量少、结果不一致，并不完全支持动物实验的结果。进一步验证睾丸对男性骨骼发育和维护的确切作用以及骨骼作为内分泌器官调控雄性生殖功能将成为未来研究的重要方向。明确骨骼与睾丸相互作用的分子信号网络将为男性性腺功能减退、骨质疏松症等疾病的诊断和治疗提供新的思路和药物作用靶点。
