线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作综合征(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes, MELAS)是最常见的原发性线粒体疾病之一。本文报道了1例罕见的由m.3252A>G(MT-TL1基因)突变导致的MELAS综合征。先证者为6岁女童，以反复抽搐和高乳酸血症为主要表现，线粒体DNA(mtDNA)基因测序示患儿及其母亲和外婆均携带m.3252A>G(MT-TL1基因)变异，该变异在患儿外周血和尿沉渣中的异质率分别为66.53%和97.42%，明显高于母系亲属。结合国外已报道的3个家系资料，该变异评级为致病性变异。通过复习国内外文献，探讨了MT-TL1基因致病变异的基因型-表型相关性。
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线粒体疾病是一组由核DNA(nuclear DNA, nDNA)或线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)变异导致氧化磷酸化功能障碍为特征的一组遗传性疾病[1]。流行病学研究表明，线粒体病整体最低患病率为1/5 000[1]。线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作综合征(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes, MELAS)是线粒体病中最常见的综合征之一，90%病例由线粒体亮氨酸转运核糖核酸1(MT-TL1)基因突变引起，其余10%由其他mtDNA或nDNA致病变异引起[2,3]。本研究对本院2020年1月收治的1例由m．3252A>G(MT-TL1基因)变异导致MELAS综合征的患者进行报道，并通过文献复习，对已报道的MT-TL1基因致病变异进行梳理，以期加深对该基因变异的基因型-表型相关性的认识，从而指导临床。
患儿女性，6岁1个月，因"半天内抽搐4次，伴呕吐1次"入院。表现为全身强直阵挛性发作，持续约1 min后自行缓解，间隔数分钟再次发作，共4次，伴高乳酸血症。患儿为第2胎第2产，出生史正常，生后智力、运动发育均落后(17个月会叫妈妈，26个月会走路，4岁会说简单句子)。患儿母亲有糖尿病，父亲体健，非近亲婚配，有1个姐姐，12岁因"酸中毒"死亡。体格检查：身高108 cm(－2 SD)，体重15.5 kg(<－2 SD)，神志清，双眼外眦上斜，前额低平，前额发际线低，毛发茂盛，分布正常。四肢肌力Ⅴ－，肌张力正常，腱反射可引出，双侧巴宾斯基征阳性，余无明显异常。辅助检查：血乳酸4.8~9.8 mmol/L(参考范围0.5~2.5 mmol/L，下同)；心肌型肌酸激酶同工酶167.1 ng/mL(0~3.61 ng/mL)；血生化肌酸肌酶282.4~757.6 U/L(25~225 U/L)、天冬氨酸转氨酶162.9 U/L(10~67 U/L)、丙氨酸转氨酶40.7~48 U/L(5~35 U/L)。血糖、血氨、遗传代谢疾病筛查正常。头颅磁共振(MRI)成像：双侧放射冠、豆状核异常信号。定期复查头颅影像学检查发现病灶缓慢进展(图1)。心电图：心室预激。心脏超声：左室肌非对称性增厚伴回声稍增强，左室心内膜局部增厚。
注：(A)~(D)先证者首诊时的影像学检查；(E)~(H)先证者6岁11个月复诊时的影像学检查；(A)计算机断层扫描(CT)显示两侧侧脑室旁卵圆形低密度灶；(B)~(D)磁共振成像(MRI)显示双侧放射冠对称性条带状异常信号，长T1长T2信号，DWI高信号影；(E)CT显示两侧侧脑室旁小片状低密度灶，较前略进展；(F)~(H)MRI显示双侧豆状核、尾状核体部见小斑片状，长T1长T2信号，DWI呈高信号
与患儿家属沟通并经过苏州大学附属儿童医院伦理委员会批准(批准文号：2021CS003)后，行基因检测。收集患儿及其母亲、外婆及舅舅外周血、尿液提取DNA，均用长程PCR/大规模并行测序(LR-PCR/MPS)方法进行mtDNA测序。流程如下：利用受检者基因组DNA，使用特异性引物进行mtDNA全长扩增，扩增产物片段化后构建基因组DNA文库(NEB #E7370L)，通过下一代高通量测序仪(Illumina)进行测序，测序数据运用NextGene V2.3.4软件比对到美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库提供的mtDNA NC_012920.1参考序列上，对筛查出的变异进行过滤，并添加Mitomap数据库注释信息。在患儿MTTL1基因中检测到m.3252A>G变异，其异质率：外周血为66.53%、尿液为97.42%；其母m.3252A>G变异的异质率：外周血为13.25%、尿液为25.08%；其外婆：外周血为1.60%、尿液为9.43%；舅舅的血和尿中未检测到该变异(图2)。治疗经过：给予鸡尾酒疗法；精氨酸改善血管内皮细胞功能；左乙拉西坦治疗癫痫；卡托普利、螺内酯减轻心脏负荷，预防心室重构；地高辛加强心肌收缩功能；并给予营养支持治疗。住院期间患儿未再抽搐，病情稳定后长期门诊随诊。1年来，仍有反复抽搐，伴头痛、呕吐等症状。
注：MT-TL1：线粒体亮氨酸转运核糖核酸1; MELAS：线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作综合征
MT-TL1基因为MELAS的常见致病基因，位于mtDNA重链，由76个核苷酸组成，负责编码转运RNA(tRNA) Leu(UUR)，后者通过识别密码子UUG和UUA携亮氨酸至延伸的多肽链，参与线粒体蛋白的合成[2,3]。由于MT-TL1基因的核苷酸序列高度保守，单一点突变就可能引起tRNA前体成熟障碍、碱基修饰缺失，进而破坏tRNA Leu(UUR)的构象稳定，降低其氨基酰化水平，导致线粒体内不稳定多肽链增多，以复合体Ⅰ或Ⅳ为主的线粒体蛋白功能受损而致病[3,4]。MT-TL1基因变异致病机制不仅仅局限于氧化磷酸化障碍导致ATP供能不足，引起大脑、肌肉等高代谢器官率先出现能量耗竭，还可引起线粒体损伤后激活的应激反应[5,6]。不同程度线粒体损伤可能激活不同的逆行信号通路，后者可以是线粒体介导的钙稳态、活性氧簇(ROS)和膜电位的变化[7]。MT-TL1基因变异的表型谱分布广，从无症状携带到致死性脑肌病均可发生[1,2,7]。其中，MELAS综合征属于较严重的表型。MELAS综合征目前暂无有效治疗方案，多以支持疗法改善症状，如补充呼吸链组分及上游物质(辅酶Q10、硫辛酸、左卡尼丁、维生素B1)；去除蓄积的有害代谢产物(降乳酸、抗氧化)；促进血管扩张(精氨酸补充一氧化氮)；对症治疗(抗癫痫、控血糖、增强肌肉锻炼)等。正因MELAS发病机制复杂，治疗手段匮乏，故从出现神经缺陷开始，患者总体中位存活时间仅为16.9年，幼年型MELAS相比成年型MELAS有更高的死亡风险[8]。
迄今已报道的m.3252A>G(MT-TL1基因)有3例[4,9,10]。首例由Morten等[9]报道，先证者为13岁女性，以线粒体脑肌病合并色素视网膜病变、痴呆、甲状旁腺功能减退和糖尿病为表型，突变异质率：肌肉为76%，外周血为30%。先证者母亲以卒中样发作和痉挛性瘫痪为表型，肌肉异质率为50%。第2例由O′Callaghan等[10]报道，以MELAS综合征，伴视力下降、听力障碍和认知延迟为表型的13岁女性患者，外周血异质率为42%。第3例由Wong等[4]报道，以偏头痛、癫痫、卒中样发作为表型的16岁男性患者，外周血异质率为42%。本研究中，先证者为6岁女童，临床以MELAS综合征为主，伴智力、运动发育落后，合并心室肌肥厚。应用Wong等[4]的线粒体tRNA变异致病性分类标准，可将m.3252A>G(MT-TL1基因)评为致病性变异(pathogenic)，证据包括PS5、PM8、PM9、PM10、PP4和PP7(证据等级：PS表示强致病性证据，PM表示中等致病性证据，PP表示辅助证据)。Wong等[4]的线粒体tRNA变异分类标准与美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南[11]对m.3252A>G的致病性评价有区别。根据ACMG指南[11]，m.3252A>G的评级为可能致病性变异，证据包括PS4_moderate、PM2、PP3、PP4(证据等级：PS4表示中等强度)。该突变破坏线粒体Ⅰ的活性，引起糖代谢紊乱和ATP产能不足，可导致MELAS综合征[9]。m.3252A>G患者从发病到死亡时间为5~27年(平均15.3年)[4,9,10]，预后不佳。本例患者发病年龄小，除具有与既往病例相似的卒中样发作、智力低下症状外，还患有预激综合征和心肌病。该患儿症状重可能与其携带m.3252A>G变异的异质率高相关。
为进一步探讨MT-TL1基因型与表型的关系，本研究以"MT-TL1 mutation""MT-TL1 variant""tRNA Leu(UUR)"为关键词检索NCBI、PubMed、OMIM、中国知网和万方数据等数据库，对MT-TL1基因中已报道的变异位点进行致病性分析。因热点突变"m.3243A>G(MT-TL1基因)"报道数量多，本文只引用相关综述，不展开对m.3243A>G的讨论[2]。本研究共收集到64篇文献，30个变异位点。根据Wong等[4]的mt-tRNA基因变异致病性分类标准重分析，其中符合致病性变异的有15个：A3243G、A3243T、A3251G、A3252G、G3255A、C3256T、T3258C、A3260G、T3271C、A3274G、A3280G、C3287A、T3291C、A3302G、C3303T；符合可能致病性变异的有7个：G3242A、G3244A、G3249A、3271delT、T3273C、G3283A、A3288G。若根据ACMG指南[11]分类，上述30个变异位点中致病性变异10个，可能致病性变异9个[4]。以变异致病性在可能致病性变异等级及以上，并且具备详细临床资料为条件，对收集的64篇文献进行筛选，最终有34篇，共计59例患者符合进一步分析的条件[4,9,10,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33]。分别整理报道中患者性别、发病年龄、首发症状、主要临床表现和突变异质水平的数据资料。59例患者中，男性21例，女性36例，未描述性别1例。描述起病年龄的有42例，通过对发病年龄与肌活检中变异异质水平的Pearson相关性分析，发现两者呈中度负相关，差异有统计学意义(图3)。在对MT-TL1基因的表型进行梳理后，按病情的严重程度进行分级，以患者是否因该变异死亡、是否累及多个系统以及病程进展速度，分为危重型、重型、普通型和轻型(图4)。危重型为致死性的、快进展的且合并其他器官功能衰竭的患者[4,9,10,12,13,14,15,16,17,18,19,20]；重型为临床症状较重的脑肌病、脑病、肌病，合并其他系统功能异常[9,17,21,22,23,24,25,26,27]；普通型为症状轻的脑肌病和全身性肌病[26,28,29,30,31]；轻型为局灶性的肌病、糖尿病、甲状腺功能减退症等[4,16,21,24,26,32,33]。有17个变异在肌肉组织中为异质性，异质率为25%~98%。有4个变异为同质性(G3242A、A3288G、A3302G和C3303T)，均以肌病或心肌病为主要表现。以中枢神经系统症状为主的致病变异有12个：A3243T、G3244A、G3249A、A3252G、G3255A、C3256T、T3258C、T3271C、3271delT、A3274G、C3287A和T3291C。总体上异质率高的变异多表现为严重的脑病、脑肌病，随异质率下降可表现为肌病或眼肌病。其中，G3244A、A3252G、C3256T、T3258C、T3271C、3271delT和T3291C变异均有MELAS综合征的表型。G3244A、T3258C、T3271C和T3291C突变会引起tRNA leu(UUR)构象改变，第34位尿嘧啶的5-牛磺酸甲基缺失而影响tRNA leu(UUR)解码能力，导致线粒体编码的呼吸链亚基中不稳定多肽链增多[34]。剩余的A3252G和C3256T变异是否有相同机制，有待进一步研究。以心肌病或肌病为主要症状的变异有9个：G3242A、A3251G、A3260G、T3273C、A3280G、G3283A、A3288G、A3302G和C3303T，其异质率和疾病严重程度的相关性不明显。如A3260G家系中异质率为87%~89%，可表现为单纯肌病或严重的心肌病[25]；C3303T异质率为98%时，心肌病患者临床表现轻重不一[20,31,33]。猜测可能与组织nDNA背景及环境等因素的影响有关。
注：MT-TL1：线粒体亮氨酸转运核糖核酸1;未包括m.3243 A>G
注：MT-TL1：线粒体亮氨酸转运核糖核酸1;横轴表示21个突变位点，纵轴表示异质率；黑色为危重型，红色为重症，蓝色为普通型，绿色为轻型，橙色为同一异质率有轻症到重症多个表型；圆形表示肌肉活检，正方形表示尿沉渣；DD：生长发育迟缓；HCM：肥厚型心肌病；RTA：肾小管性酸中毒；ENC：脑病；SHL：感觉神经性听力丧失；GHD：生长激素缺乏症；PEO：进行性眼外肌麻痹；EI：运动耐量不足；MELAS：线粒体脑肌病伴高乳酸血症、卒中样发作综合征；KS-like：PEO、小脑共济失调、肌病色素视网膜病变；MYO：线粒体肌病；DEM：痴呆；RF：肾功能衰竭；MERRF：肌阵挛性癫痫伴随红纤维病；KSS：Kearns Sayre综合征；PSY：精神障碍；DM：糖尿病；CMYO：心肌病；HF：心力衰竭；RSF：呼吸衰竭；CEA：小脑萎缩；ATX：共济失调；WPW：WPW预激综合征
综上，本研究患者为国内首例报道的m.3252A>G(MT-TL1基因)变异导致的MELAS综合征。本案例存在的心脏功能和结构异常在既往文献中未曾报道，丰富了该变异的表型谱。MT-TL1基因变异的异质率水平与患者发病年龄呈负相关，且在累及中枢神经系统的变异中，异质率越高则临床表型越重。
姑苏卫生人才计划(GSWS2020046, GSWS2019051);苏州市科技计划民生科技(SS202064, SS202091);苏州市临床医学中心(Szlcyxzxj202105)
所有作者均声明不存在利益冲突
