建立2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M和IgG胶体金快速检测方法，并对检测试剂进行临床性能评价。
收集2020年2月12日至20日分别在武汉市汉口医院和洪湖市人民医院就诊的共278例患者，根据诊断标准分成2019-nCoV核酸阳性的确诊患者89例和2019-nCoV核酸阴性的疑似患者189例。选取2015年至2018年南方医科大学南方医院的273名体检者作为对照。采集患者血清样本。采用原核表达载体获得2019-nCoV病毒重组核蛋白，利用重组核蛋白分别建立间接法IgM和IgG胶体金检测方法，以核酸反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测方法作为对照，对3组人群的血清标本进行2019-nCoV IgM和IgG检测，分析胶体金检测法的特异度和灵敏度。
采用胶体金试剂检测核酸阳性的确诊患者的2019-nCoV IgM和IgG阳性检出率分别为78.7%(70/89)和73.0%(65/89)；体检者的2019-nCoV IgM和IgG阳性检出率分别为1.8%(5/273)和0.7%(2/273)。2019-nCoV IgM检测胶体金试剂的灵敏度和特异度分别为78.7%和98.2%, 2019-nCoV IgG检测试剂的灵敏度和特异度分别为73.0%和99.3%,联合IgM和IgG检测的灵敏度和特异度分别为87.6%和98.2%。核酸阴性的疑似患者的2019-nCoV IgM和IgG阳性检出率分别为59.8%(113/189)和52.9%(100/189)，IgM和IgG联合检测阳性检出率为66.1%(125/189)。
2019-nCoV抗体检测试剂(胶体金法)的特异度和灵敏度高，可作为已有的2019-nCoV核酸RT-PCR检测法的补充手段。
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新型冠状病毒肺炎疫情自发生以来在全国迅速蔓延，严重威胁人们的生命安全和身体健康[1,2]。国家卫生健康委办公厅发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中以实时荧光反转录PCR和病毒基因测序为病原学确诊证据[3]。由于采样、操作和试剂等多方面因素影响，核酸检测会出现假阴性结果。目前已有回顾性研究表明，高度疑似2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)感染患者的病毒核酸阳性检出率仅为30%～50%[4]。另外，核酸检测对仪器设备、检测场地和环境条件的要求较高，需要经熟练培训的技术人员进行操作，存在检测时间长、通量低等缺点，不便于在目前疫情下进行人群大规模检测。因此，迫切需要研发出一种快速、便捷的检测试剂盒用于临床检测，筛选出潜在的病毒阳性感染者，从而尽快隔离感染人群以阻断病毒传播。
为了研制出高灵敏度和高特异度且满足临床检测需求的快速、便捷的检测试剂，本研究通过原核表达载体表达2019-nCoV核蛋白，分别建立间接免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M和IgG快速检测胶体金分析试剂，并对其进行临床性能评价，评估其在2019-nCoV感染者中的阳性检出率，以及在对照人群中的假阳性率是否满足临床检测需求，为2019-nCoV感染的诊断手段提供更多依据。
收集2020年2月12日至20日在武汉市汉口医院就诊的54例患者和在洪湖市人民医院就诊的224例患者，参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》的诊断标准[3]，根据流行病学史、临床表现、血常规、影像学检查，以及患者咽拭子2019-nCoV核酸反转录PCR检测的结果，分成2019-nCoV核酸阳性的确诊患者89例，2019-nCoV核酸阴性的疑似患者189例。另选取2015年至2018年南方医科大学南方医院的273名体检者作为对照。本研究经过南方医科大学南方医院伦理委员会审批通过(NFEC-2020-026)。
DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞、原核表达载体pET32a (＋)由本课题组实验室保存，硝酸纤维素膜(型号为CN140)购自德国Sartorius Stedim公司，聚氯乙烯胶板、吸水垫(ABP-S370)和玻璃纤维(SAP-Z80B)均购自怀远县通成纸制品有限公司，氯金酸(520918-1G)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，塑料卡壳购自宁波市海曙顺源塑料厂，pMD-19T(6013)、PrimeSTAR® Max DNA聚合酶(R045Q)和PrimeScript™ Ⅱ 1st Strand cDNA合成试剂盒(6210A)均购自宝生物工程(大连)有限公司，无缝克隆试剂盒(ZC231)购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，鼠抗人IgM单克隆抗体(A37130)和抗人IgG单克隆抗体(A37420)均购自美国Biospacific公司，羊抗鼠IgG多克隆抗体(610-1103)购自美国Rockland公司，其余试剂均为分析纯。
2019-nCoV RNA基因组由广州市中山大学达安基因股份有限公司惠赠。采用随机引物进行反转录后获取总cDNA。根据GenBank数据库(基因组序列号为MN908947.3)公布的相关序列信息，设计病毒重组核蛋白(以下简称N蛋白)基因特异性引物(NP正向引物为5′-ATGTCTGATAATGGACCCC-AAAATC-3′；NP反向引物为5′-TTAGGCCTGAGTT-GAGTCAGC-3′)，并进行PCR扩增获得N蛋白全长序列。随后回收PCR产物装载于pMD-19T质粒后转化DH5α感受态，挑取阳性克隆测序鉴定。设计同源臂引物(NP32正向引物为5′-AGCTCCGTCGA-CAAGCTTGCATGTCTGATAATGGACCCCAAAAT-3′；NP32反向引物为5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAG-TGCGGCCGCGGCCTGAGTTGAGTCAGCACT-3′)，以pMD-19T/N为模板进行PCR扩增，回收产物并装载pET32a(＋)质粒。经测序鉴定后，将重组pET32a/N质粒转化入大肠埃希菌BL21 (DE3)感受态细胞中，于37 ℃振荡培养至吸光度值为0.4～0.6后，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，20 ℃诱导过夜。重组2019-nCoV N蛋白抗原纯化后，采用2019-nCoV阳性血清进行蛋白质印迹法鉴定，之后4 ℃保存备用。
采用柠檬酸三钠还原法，取质量分数为1×10－4的氯金酸水溶液100 mL，加热至沸腾，快速加入1.75 mL的1%柠檬酸三钠，反应10 min冷却后将溶液倒入洁净玻璃器皿，采用分光光度计测定制备的胶体金的最大吸收峰值，于4 ℃存放备用。
胶体金溶液(100 mL)中加入2 mL碳酸钾溶液(0.1 mol/L)并搅拌均匀，再向其中加入1 mg鼠抗人IgG单克隆抗体，反应15 min后再向其中加入10%牛血清白蛋白溶液10 mL，封闭10 min，将上述抗体标记好的胶体金溶液转移至离心管中，4 ℃10 000 r/min(离心半径为10 cm)离心30 min，弃除上清液，加入3 mL的pH值为8.2的PBS(0.02 mol/L，含1%牛血清白蛋白)溶液来复溶沉淀，4 ℃保存备用。采用相同方法对鼠抗人IgM单克隆抗体进行胶体金标记。
玻璃纤维膜置于浸泡液30 min后取出，在37 ℃烘箱中干燥18 h后按样品垫规格裁剪，干燥、密封于室温保存。将制备的鼠抗人IgG及IgM单克隆抗体-胶体金结合物喷涂至制备好的玻璃纤维膜上，37 ℃烘箱中干燥18 h后取出，干燥、密封于室温保存。
将2019-nCoV N蛋白抗原浓度配制成2 mg/mL，按0.1 μL/mm划线量在硝酸纤维素膜上制备检测T线；将羊抗鼠IgG多克隆抗体浓度配制成2 mg/mL，按0.1 μL/mm划线量在硝酸纤维素膜上制备质控C线；于37 ℃烘箱中干燥18 h后，干燥、密封于室温保存。
在干燥室中将硝酸纤维素膜、吸水垫、胶体金结合垫、样品垫依次粘贴在聚氯乙烯板上，切割成宽度为4.0 mm的试剂条，将试剂条装入塑料卡内，置于含干燥剂的铝箔袋中，热合封口待用。
如图1所示，以检测IgG为例，经1∶50比例稀释的血清样本100 μL滴加于样本垫，样本向吸水材料方向流动途经胶体金结合垫时，样本中的人抗2019-nCoV IgG抗体与胶体金标记的鼠抗人IgG单克隆抗体发生特异性结合，形成胶体金-鼠抗人IgG-人抗2019-nCoV IgG抗体复合物，复合物继续向吸水材料方向移动，途经检测线T区时被2019-nCoV N蛋白重组抗原捕获，从而使检测线T显色，过量未反应的胶体金标记的鼠抗人IgG则继续向前迁移，途经质控线C区时被羊抗鼠多克隆抗体捕获而使质控线C显色。
注：2019-nCoV为2019新型冠状病毒
以2019-nCoV核酸阳性的确诊患者为阳性对照，对照体检者为阴性对照，确定2019-nCoV IgM和IgG胶体金试剂盒的灵敏度和特异度等指标，判定试剂盒检测性能是否满足临床诊断应用需求。最后使用该试剂盒检测2019-nCoV核酸阴性的疑似患者的血清IgM和IgG。
PCR扩增出的N蛋白基因特异性产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，可见完整清晰的条带，与预期目的基因大小一致，见图2。PCR纯化产物与pMD19-T simple vector载体连接后转化DH5α感受态细胞，获得重组质粒pMD19-T/N。
注：M为DNA标志物；泳道1为核蛋白基因扩增产物
重组N蛋白阳性克隆菌株(pET-32a/N)在转化原核表达细菌BL21 (DE3)中进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示：经IPTG在20 ℃培养环境中诱导过夜后，在相对分子质量70 000处可见N蛋白的表达。见图3。
注：M为蛋白质标志物；泳道1为诱导前样品；泳道2为诱导后样品
经His标签镍柱纯化系统纯化的样品再经SDS-PAGE鉴定，可见pET32a/N表达产物在相对分子质量70 000处有明显较单一的重组蛋白表达条带。纯化的重组N蛋白采用阳性血清经蛋白质印迹法鉴定，结果呈现阳性反应，证明表达产物抗原性较好。见图4。
注：SDS-PAGE为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。M为蛋白质标志物；泳道1和2均为纯化后样品；泳道3为纯化样品蛋白质印迹法鉴定结果
采用2019-nCoV IgM和IgG胶体金试剂盒检测核酸阳性确诊患者和对照体检者的结果发现，体检者的血清IgM和IgG检测均为阴性，见图5A；2019-nCoV核酸阳性确诊患者的血清IgM和IgG检测均为阳性，见图5B。将1例确诊患者的血清标本分别按1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560的比例稀释，并设立阴性对照，可见阳性条带在稀释到1 280倍时依然可见，见图5C。
注：2019-nCoV为2019新型冠状病毒；Ig为免疫球蛋白
对89例2019-nCoV核酸阳性的确诊患者、189例2019-nCoV核酸阴性的疑似患者和273例对照体检者进行胶体金检测，抗体阳性检出率结果见表1。
2019-nCoV核酸阳性的确诊患者、核酸阴性的疑似患者和对照体检者的胶体金检测阳性率[例(%)]
2019-nCoV核酸阳性的确诊患者、核酸阴性的疑似患者和对照体检者的胶体金检测阳性率[例(%)]
| 组别 | 例数 | 2019-nCoV核酸阳性率 | 2019-nCoV IgM阳性率 | 2019-nCoV IgG阳性率 |
|---|---|---|---|---|
| 核酸阳性的确诊患者 | 89 | 89(100) | 70 (78.7) | 65 (73.0) |
| 核酸阴性的疑似患者 | 189 | ND | 113 (59.8) | 100 (52.9) |
| 对照体检者 | 273 | NA | 5 (1.8) | 2 (0.7) |
注：2019-nCoV为2019新型冠状病毒；Ig为免疫球蛋白。ND为低于检测下限；NA为不适用
将2019-nCoV核酸阳性的确诊患者设为阳性对照，由于目前反转录PCR核酸检测法的漏检率较高，核酸阴性的疑似患者不适于设为阴性对照，故选用2019-nCoV感染流行之前(2015年至2018年)的体检者设为阴性对照。通过检测和计算发现，2019-nCoV IgM检测试剂的灵敏度和特异度分别为78.7%和98.2%，2019-nCoV IgG检测试剂的灵敏度和特异度分别为73.0%和99.3%，联合IgM和IgG检测的灵敏度和特异度分别为87.6%和98.2%。
采用胶体金试剂盒对189例2019-nCoV核酸阴性的疑似患者血清标本进行鉴定分析，发现疑似患者的2019-nCoV IgM和IgG阳性检出率分别为59.8%(113/189)和52.9%(100/189), IgM和IgG联合检测阳性检出率为66.1%(125/189)。可见2019-nCoV核酸阴性的疑似患者中，有66.1%的患者有可能感染了2019-nCoV。
2019-nCoV具有很强的传染性，多数患者感染后出现临床症状，但也有部分患者为无症状感染者，也可能成为传染源，这给疫情防控和临床诊断带来巨大挑战[5]。当前批准的多种核酸检测产品虽然解决了大量存量患者确诊的难题，但受限于取样、检测试剂和检测人员等影响，核酸检测存在检出率较低、耗时长等不足之处，难以进行大规模筛查以发现潜在的阳性感染者。WHO提出，在无法使用2019-nCoV核酸检测时建议使用血清学进行诊断[6]。在既往严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、H7N9型禽流感和寨卡病毒流行期间，均以免疫学技术作为疾病诊断的补充手段[7,8,9]。
本研究采用的2019-nCoV IgM和IgG快速检测试剂盒是通过胶体金免疫层析技术来实现，只需采集患者静脉血，安全性和便捷性高于咽拭子采样，大大降低医护人员被感染和病毒传播的风险，而且不需要任何设备，15 min内就可以获得检测结果。然而胶体金法也存在不足之处，比如灵敏度低、易受到干扰。冠状病毒的N蛋白非常保守，具有很强的抗原性，而且在病毒感染过程中过度表达，因此极有可能诱导机体产生大量针对N蛋白的抗体。本研究同步采用原核和真核表达系统进行2019-nCoV多种病毒蛋白表达，并针对多种蛋白质特异多肽片段进行融合表达，以多种蛋白质进行优化组合，筛选出特异度高的蛋白质或组合，为开发出灵敏度高、特异度强的胶体金试剂盒提供了保障。
本研究通过对2019-nCoV核酸阳性确诊患者的血清样本检测发现，2019-nCoV IgM与IgG检测阳性率均大于70%。考虑到IgM可能在病毒感染后1周出现，而IgG可能在感染后2周出现[10]，在流行病学史不详的情况下检测2019-nCoV时，建议同时检测IgM和IgG，检测灵敏度可达87.6%。值得注意的是，在咽拭子核酸检测呈阴性的疑似患者中，联合IgM和IgG检测的阳性检出率为66.1%，另外本课题组对2例咽拭子核酸检测阴性但肺泡灌洗液核酸检测为阳性的患者使用本胶体金试剂盒检测发现，可检测到IgM和IgG阳性(数据尚未发表)。可见对于咽拭子核酸检测为阴性的疑似患者，检测血清中抗体是对疾病诊断的重要补充手段。除此之外，检测试剂盒的特异度也是备受关注的问题。据文献报道，健康献血者中冠状病毒229E和OC43的阳性率分别为98%和100%[11]。本研究273名对照体检者血清样本的抗体检测阳性率低于2%，且与HBV、甲型流行性感冒病毒、乙型流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒感染者的血清并没有交叉反应，表明本研究试剂盒检测的抗体与常见冠状病毒不存在交叉反应，但后续仍需进一步验证试剂盒检测抗体与其他冠状病毒，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)是否有交叉反应。最新研究发现，2019-nCoV感染者的唾液核酸检测阳性率高达92%，通过病毒培养在唾液中可检测到活病毒[12]。由此可见，唾液是一种颇具潜力的无创检测标本，可用于2019-nCoV感染者的诊断和病情监测。本研究开发的试剂盒目前可用于检测血清、血浆和全血标本中的病毒抗体，后期将会拓展到唾液、尿液等标本的检测，具有更广泛的适用性。
综上所述，本研究设计的2019-nCoV抗体检测试剂盒(胶体金法)具有快速、便捷，以及灵敏度和特异度高等优点，可弥补核酸检测条件要求高、耗时长、阳性率较低的不足之处，可作为疾病诊断的重要补充检测手段，且适合于人群快速筛查，有利于感染防控。为了缩短检测窗口期，提高阳性检出率，在后续的临床实践研究中，可进一步采用核酸、抗原和抗体多种检测方式，以及联合咽拭子、唾液、粪便和血液等多种样本进行检测诊断，这对于2019-nCoV感染的诊断和防控具有重要意义。
所有作者均声明不存在利益冲突
