版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
在皮肤科临床研究中，多光子显微成像技术可以避免侵入性活组织检查，并且可以提供治疗前、中、后的皮肤状态信息。利用内源性多光子信号：由纤维状的胶原蛋白产生的二次谐波和由角蛋白、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黑色素或弹性蛋白发出的双光子激发荧光，可以显示160 ~ 200 μm深度的表皮和真皮浅层特征，分辨率可达亚微米级。
医疗级多光子显微成像技术可揭示皮肤色素沉着、皮肤老化或光老化、皮肤疾病和黑素瘤的特征，评价药品/化妆品的皮肤渗透性和功效。
通过适当的图像处理工具，可以从人体皮肤的多光子成像提取很多有价值的信息。本研究开发了第一个三维（3D）图像处理工具，可以对皮肤的不同层次进行自动分割，并提取其中的一些定量参数。例如，可以在3D图像中测量表皮厚度、黑色素含量或真-表皮交界（DEJ）的形态。我们使用这些工具对光老化、色素沉着或美白相关的一些定量参数进行了验证，并且在封闭性斑贴试验方案中证实，多光子成像可以准确且无创地检测和量化视黄醇和维A酸引起的皮肤效应。然而，该研究模型并不能代表现实情况，因为封闭本身会产生一定影响，还可能促进药物的渗透。
本研究旨在应用多光子成像对现实生活中使用视黄醇和维A酸1年以上引起的皮肤效应进行评价，并且基于这些抗老金标准成分，对多光子定量参数变化幅度的设定进行校正。
本研究招募了30名50 ~ 65岁的健康欧洲女性，伴有皮肤光损伤，前臂伸侧肤色ITA值10° ~ 41°（肤色程度为晒黑至中度晒黑）。志愿者在一侧前臂的伸侧涂抹欧莱雅集团生产的0.3%视黄醇乳膏（n = 15），或外用0.025%维A酸乳膏（n = 15），在另一侧前臂涂抹对照产品（含辅料的白色石蜡）。研究为期1年，第1个月隔日1次，随后每日1次连续涂抹。此外，建议志愿者在夏季避免日光暴露，不可避免时使用提供的SPF 50防晒霜。遵照随机表分配前臂左侧或右侧涂抹的产品。本研究为双盲设计，即研究者和志愿者均不知道手臂上涂抹何种产品。
本研究于2011年2月至2012年4月在法国巴黎进行。采用多光子成像和色度检测方法在M00（2011年3月）、M03（2011年6月）、M06（2011年9月）和M12（2012年3月）对同一部位进行检测。通过在透明塑料片上追踪天然解剖标志（前臂内外边缘、尺骨头、肘窝）以及志愿者在标准体位的皮肤皱褶和痣的位置来明确测量区域。在M12取活组织进行组织学分析。每次就诊时，皮肤科医生跟踪随访可能的皮肤刺激反应。如有必要，可在第1个月后继续隔日涂抹试验产品，直至耐受。
本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，经圣路易医院伦理委员会批准，所有志愿者均签署了知情同意书。
多光子成像和3D图像处理、组织学分析、色度检测和统计学方法详见原文。
测量3D图像中角质层以下的表皮（living epidermis，LED）厚度。基线LED厚度为（50 ± 9） μm，在试验组与对照组之间没有差异。与M00相比，除M03视黄醇对照组外（+6.6 μm；P未达显著，中等效应量），其他对照组LED厚度在研究期间保持不变。
在视黄醇组，与M00相比，M03（+11.1 μm，P = 0.003，强效应量）和M12（+18.5 μm，P < 0.001，极强效应量）的LED平均厚度显著增加。在M12，视黄醇组LED厚度的增加值也显著高于对照组（+20.5 μm，P < 0.001，极强效应量）。
维A酸组与对照组相比，在M06和M12观察到LED平均厚度略微增加，呈中等效应量，但差异无统计学意义（P未达显著）。
在基线，平均DEJ标准化面积（表示DEJ起伏的3D指标）为1.7 ± 0.3，在试验组与对照组之间没有差异，并且对照组在研究期间均保持不变。视黄醇组在M12增加至1.9 ± 0.3，与M00和对照组相比P未达显著，为中等效应量。维A酸组未观察到与M00或对照组之间的差异。
在基线，表皮黑色素密度为14% ± 0.1%，在试验组与对照组之间没有差异。与维A酸组M00相比，在M06（夏季之后）可以观察到平均表皮黑色素密度显著增加9% ~ 15%（P < 0.005，强至极强效应量），并且在试验组与对照组之间没有差异。在M12，视黄醇对照组的平均表皮黑色素密度下降至M00水平，而维A酸对照组的黑色素密度与M00相比仍呈持续增加（+7%，P = 0.019，强效应量）。在M12，两个试验组的平均表皮黑色素密度均下降至M00水平，视黄醇组与对照组相比没有差异，维A酸组与对照组相比略有差异（-6%，P未达显著，中等效应量）。
对照组表皮黑色素纵向分布的分析结果显示，整体黑色素密度渐进性增加是由于基底层内的黑色素密度增加所致，在M03可达表皮中部，在M06（夏季之后）贯穿整个表皮。M12与M00相比，在基底层、基底上层以及在角质层水平上，可以观察到黑色素持续累积。
夏季（M06）对两个试验组黑色素分布的影响最大，该影响在两个试验组之间没有差异。在M03和M12，对照组基底上层黑色素增加，但试验组未见增加。在视黄醇组，不同时间点的表皮黑色素密度纵向分布曲线与M00重合；在维A酸组，表皮内侧1/3处的黑色素密度甚至在M12略有下降，这与该时间点观察到的表皮黑色素密度的变化一致。
在M12，与多光子成像结果一致，皮肤标本HE染色定量检测结果显示，与对照组相比，在视黄醇和维A酸处理后，表皮厚度分别平均增加了19.6 μm（P = 0.002，极强效应量）和10.4 μm（P未达显著，中等效应量）。DEJ起伏的增加没有统计学意义，但与对照组相比，视黄醇组呈中等效应量。黑色素、弹性纤维和胶原蛋白的组织学定量结果显示，在M12时维A酸组和对照组之间差异无统计学意义。
对于所有试验组和对照组，基线ITA值为38° ± 7°，至M03降低约5°（P < 0.015，除了维A酸组P未达显著且呈弱效应量之外，其他均为中等效应量），M06降低约10°（P < 0.001，强至极强效应量），提示中度晒黑，在M12再次升高至基线值。在这个过程中，各组间差异均无统计学意义。
尽管在研究的第1个月内要求隔日涂抹产品，仍有14例使用视黄醇和6例使用维A酸的志愿者出现红斑、轻微烧灼感或刺痛，多数为暂时性，列为轻度不良反应。有5例分别延长了隔日使用时间1个月（1例维A酸、1例视黄醇）、4个月（1例视黄醇）和整个研究期间（2例视黄醇），1例在M06退出了研究（视黄醇）。
应用于人体的多光子成像具有视野小、图像采集时间长、成本高，并且对专业知识和技术掌握要求高等限制因素，但其极佳的特异性可以提供人体皮肤成分的定量信息。本研究证实，多光子成像结合特定的3D图像处理工具能够对皮肤/美容产品治疗的时间效应进行评价。3D多光子成像和2D组织学分析证实，使用视黄醇和维A酸1年后可以增加表皮的厚度。我们曾报道0.3%视黄醇封闭性斑贴试验应用多光子成像观测到DEJ起伏增加。本研究中，使用视黄醇1年后，多光子成像（与M00和对照相比）和组织学分析（与对照相比）均观察到DEJ起伏值轻微增加，且呈中等效应量，但差异无统计学意义。与之前的研究一致，本研究中0.3%视黄醇对表皮的改善作用强于0.025%维A酸。
除了表皮形态学改变以外，多光子成像技术还能特异性地检测、定量和描述黑色素在表皮内确切的3D分布信息。本研究表明，整体的黑色素密度随季节发生变化，在夏季呈显著增加。值得注意的是，由于志愿者严格遵从试验方案，在夏季使用防晒措施，色素沉着的增加很低，ITA平均仅减少10°，相当于冬季在相同年龄和光皮肤类型的健康志愿者中观察到的前臂伸侧和屈侧之间的颜色差异，夏季对黑色素密度的影响较弱。
本研究通过对表皮黑色素纵向分布的观察，可以识别整体水平上不容易检测到的或与之相关的微小变化。对照部位在1年后的黑色素纵向分布曲线表明，黑色素在基底上层即表皮内侧1/3处持续存在。在其他研究中也已观察到相同的黑色素分布模式，这些研究或比较了同一志愿者长期日光暴露与非暴露的皮肤，或对比了老年人与年轻人相同的光暴露部位不同季节的差异。黑色素持续进入表皮基底上层可能是对欧洲人皮肤光老化的一个新描述，其优于其他光老化标记物之处在于能够检测到1年的变化，而DEJ变平或表皮变薄在如此短的时间内无法被检测到。此外，通过观察抗老金标准成分（类维生素A）对表皮黑色素纵向分布的改善，提示黑色素纵向分布相关参数可用于抗光老化产品的评价。
视黄醇和维A酸乳膏处理对皮肤黑色素含量及黑色素在表皮分布的影响结果也有力支持了类维生素A对色素沉着的主要作用方式更可能是通过促进皮肤的更新，而非文献报道中对黑色素生成的直接影响。
如前所述，在正常未处理的皮肤中，多光子成像还可以研究深度约达150 μm的人体皮肤（大约对应80 μm深度的真皮浅层）。在试验组与对照组之间观察的真皮最大范围仅限于DEJ下方30 μm的真皮层。这与视黄醇组的平均表皮增厚达30%有关，其中1/3的志愿者甚至超过50%。在这些情况下，无法通过多光子成像对真皮浅层进行评价。标准的组织学分析未能观察到真皮纤维网络在1年中发生显著的量变。尽管已知类维生素A可以增加Ⅰ型前胶原的表达，却难以证实类维生素A对胶原蛋白增加的直接作用，并且弹性组织变性只有在4年之后才能被观察到。因此，我们认为上述研究无法通过多光子成像检测真皮的变化。
本研究首次证实在现实条件下，结合特定的3D图像处理工具，多光子成像技术能够准确、无创地定量护肤产品使用后产生的表皮效应，例如黑色素含量。本研究首次分析了表皮黑色素的纵向分布，为季节和类维生素A对色素沉着的影响提供了新观点。在对表皮黑色素分布及其关键的DNA防护作用有一定了解的前提下，本研究中的新方法可提高我们对色素调节生物学机制的认识，涉及现有黑色素重新分布和/或新生黑色素合成。基于多光子成像技术的黑色素定量，其应用范围从研究生理性、病理性或环境因素诱导的色素沉着，到评价美白、抗光老化或光防护产品的功效，具有广阔的前景。
