探讨运用液相色谱-质谱(LC-MS)检测血清中的6种雄激素水平对干燥综合征(Sjögren's syndrome，SS)的诊断价值。
选择32例SS患者(SS组)及体检的25例体检者(健康组)。采集的血清样本经处理后，运用LC-MS进行6种雄激素水平分析。实验数据处理使用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法－判别分析(PLS-DA)及t检验考察SS组与健康组间激素水平差异。
PLS-DA分析结果表明，6项雄激素可以良好区分SS组与健康组样本。相比较，SS组睾酮(T)(0.17±0.02)ng/mL、二氢睾酮(DHT)(103.72±14.81)ng/mL、脱氢表雄酮(DHEA)(2.7±0.29)ng/mL、雄酮(0.08±0.01)ng/mL及脱氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)(795.93±91.68)ng/mL水平，均低于健康组的(0.80±0.08)ng/mL、(150.65±9.92)ng/mL、(4.04±0.28)ng/mL、(0.15±0.02)ng/mL、(1 360.88±76.10)ng/mL，差异均有统计学意义(t＝8.536、2.438、3.172、4.158、4.489，均P<0.05)。PLS-DA分析也可以分别对绝经前及绝经后的两组样本加以区分。
通过LC-MS检测血清中6种雄激素，获得了SS组与健康组的差异性雄激素，可为SS诊疗带来新的思路。
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干燥综合征(Sjögren's syndrome，SS)是一种慢性全身自身免疫性疾病，发病率为0.1%～0.6%。该病发病原因及发病机制目前尚不明确，但其流行病学特点提示，该病与性激素有一定关系。Nazmul-Hossain等[1]发现90%罹患SS的患者是处于围绝经期和绝经期的中年女性，而该年龄段女性卵巢功能出现退化且雌激素分泌水平降低，推测该病与患者体内雌激素过低有关[2]。早期就有报道小鼠芳香化酶的敲除引起了局灶性淋巴腺炎以及一些自身免疫抗体[3]；当用芳香化酶抑制剂治疗乳腺癌患者时，其中有SS倾向的患者出现了SS的典型特征[4]。然而，雌激素过低不足以解释男性发病率低于女性的现象。
雄激素具有保护机体免受自身免疫性疾病威胁的作用。Trokovic等[5]指出，雄激素可以保护唾液腺上皮细胞免受凋亡。Mostafa等[6]将小鼠卵巢进行切除，发现性激素水平急剧降低，并累及泪腺淋巴细胞，最终导致上皮细胞死亡；而当用二氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)以及雌二醇(Estradiol，E2)对切除后的小鼠进行治疗时，则可以避免以上出现的症状。多项研究发现，SS患者血清及唾液中的脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)及脱氢表雄酮硫酸盐(Dehydroisoandrosterone 3-sulfate sodium salt dihydrate，DHEAS)水平显著低于健康人[7,8,9]，过低的DHEA造成唾液中雄激素依赖的CRISP-3表达水平降低，从而对唾液腺细胞造成影响。这些研究揭示，雄激素的减少可能是SS的关键病因。
然而，目前的大部分研究考察的是较少的几项雄激素，还未见对雄激素比较系统的研究。另外，不容忽视的是，在寻找差异性激素时，研究者们大多采用的是Elisa、RIA等间接方法[7,8]。该类方法在检测激素时存在交叉反应，导致检测结果偏高等不良影响[9,10,11,12]，难以真实反映体内激素真实水平。液相色谱-质谱(LC-MS)检测方法通过直接检测物质的荷质比来实现，避免了以上种种弊端，且具有更高的灵敏度及可重复性。在本实验中，我们运用LC-MS的方法检测SS患者及健康人血清中6项雄激素，并进行了多元统计及t检验分析。
选择2015年6～12月绍兴第二医院、浙江中医药大学附属第二医院及浙江省中医院体检中心的SS患者32例样本(SS组)，其中绝经前女性13例，绝经后女性19例。选取同时期健康体检样本25例。样本采集时间均为以上群体未绝经者月经周期的第3天，绝经者样本则随机采集。SS组年龄(50.72±0.27)岁，健康组年龄(50.72±0.34)岁。采集的血清样本存放于－80 ℃冰箱中。研究中排除既往曾经发生多囊卵巢综合征、糖尿病、肥胖等引起激素变化的疾病及有饮酒史、抽烟史、熬夜史者。
液相色谱Agilent1290(美国Agilent公司)，质谱仪Agilent6495(美国Agilent公司)；高速冷冻离心机(Beckman Coulter公司)；电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
甲醇、乙腈为色谱纯级试剂购买自Merck(Darmstadt，Germany)；实验中所用的标准品DHEA、DHEAS、雄烯二酮(Androstenedione，A-dione)、睾酮(Testerone，T)、二氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)、雄酮(Androsterone)及d3-T，均购买自Sigma公司；超纯水采用Milli-Q超纯水系统制备。
液相色谱采用Agilent 1290 HPLC，使用的色谱柱为Agilent-C18(3.0×50 mm，2.7 μm)(美国Agilent公司)。柱温箱温度为35 ℃，进样量为5 μL。流动相为0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)，流速0.4 mL/min。实验时，采用梯度洗脱方式，具体为：0～7 min，A-B：(90∶10)→(5∶95)；7～10 min，A-B：(5∶95)→(70∶30)；10～10.1 min，A-B：(70∶30)→(90∶10)，并保持至14 min。
质谱检测采用Agilent 6495，离子源类型为ESI，采用正离子模式进行检测。离子源温度为250 ℃。同时监测：DHEA(304.1→253.1)，DHEA-S(384.2→286.2)，A-dione(317→124)，T(304.1→124)，DHT(306.1→81)，Androsterone(306.3→255.1)。碰撞电压(collision energy，CE)等条件进行了系统优化，以便达到最佳的稳定性和灵敏度。
血清4 ℃下复溶，取150 μL于1.5 mL离心管中，加入600 μL乙腈，涡旋震荡30 s；混合液在4 ℃下15 000 rpm离心10 min，取上清冻干；将其复溶于150 μL 10 mmol/L盐酸羟胺，60 ℃水浴衍生30 min，离心后取上清供LC-MS分析。取一定数量的混合质控(Quality Control，QC)样本被用于监控分析序列的重复性和稳定性，预处理方法同上。
多元统计分析采用SIMCA-P 13.0(Umetrics，Umea，Sweden)软件；单因素统计分析采用应用GraphPad Prism 6.01(GraphPad Software，USA)进行t检验。项目比较结果以P<0.05为差异有统计学意义。
SS组与健康组样本年龄差异无统计学意义(P>0.05)，可以进行相互间的激素水平比较。应用建立的LC-MS检测方法测定了SS组和健康组血清中的6种雄激素水平，并进行准确定量。在分析序列中等间距加入量7个QC样品以检测检测的可靠性。将测定的激素浓度组建数据矩阵，输入SIMCA-P软件，UV scaling条件下，PCA得分图见图2。
从PCA得分图上，QC样本点分布集中，表明分析数据具有良好的重复性和可靠性。而SS组与健康组虽然表现了一定的分离趋势，但是却不能完全的分离开来。
为更好区分SS组及健康组，采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)单独处理两组数据，获得得分图(图3a)和载荷图(图3b)，从得分图上可以看出SS组和健康组可以获得完全的区分。分析所采用的数据模型主成分为2，R2Y为0.642，Q2为0.514，交叉验证R2和Q2截距分别为0.032和-0.162。上述参数表明模型没有出现过拟合，结果是可信的。从载荷图上可以看出，所有检测的6种雄激素水平都不同程度地与SS组呈负相关。
为了进一步探讨这几种激素在两种疾病中的差异，分别对这6种雄激素水平进行t检验。结果发现，在SS和健康组中，除了A-dione以外，其他几种激素差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。
SS组与健康组6种雄激素比较(
±s)
SS组与健康组6种雄激素比较(±s)
| 组别 | 例数 | T(ng/mL) | A-dione(ng/mL) | DHT(pg/mL) | DHEA(ng/mL) | 雄酮(ng/mL) | DHEAS(ng/mL) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| SS组 | 32 | 0.17±0.02 | 0.62±0.06 | 103.72±14.81 | 2.70±0.29 | 0.08±0.01 | 795.93±91.68 |
| 健康组 | 25 | 0.80±0.08 | 0.84±0.09 | 150.65±9.92 | 4.04±0.28 | 0.15±0.02 | 1 360.88±76.10 |
| t值 | 8.536 | 1.983 | 2.438 | 3.172 | 4.158 | 4.489 | |
| P值 | <0.05 | 0.0524 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
由于大部分SS患者是绝经后女性，为了进一步观察绝经前后女性雄激素变化，我们对各个人群的绝经前后激素水平进行了进一步比较，以研究绝经与否在区分这些样本时的意义。结果发现，无论用PCA主成分分析还是采用PLS-DA处理数据，四组区分不明显。而无论绝经前的SS组与绝经前的健康组相比，还是绝经后的SS组与绝经后的健康组相比，PLS-DA处理数据后都可以将其进行良好的区分。对各项激素水平分别进行t检验后发现，绝经前的SS患者及绝经前的健康人群，T和雄酮差异有统计学意义(P<0.05)；而绝经后的SS患者及绝经后的健康人群，除了T和雄酮外，DHT、DHEA及DHEAS的差异有统计学意义(P<0.05)。雄酮是T的最终代谢产物，T的降低导致了雄酮水平的低下。
本研究通过LC-MS方法检测了SS患者以及健康人血清6项雄激素，运用多元统计及单因素分析方法对其进行了差异的研究。结果发现，两组人群可以通过PLS-DA良好区分。在SS组和健康组有5项激素即T、DHT、DHEA、雄酮及DHEAS差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分别考察绝经前和绝经后人群后发现，T和雄酮是绝经前后SS患者及健康人共同的差异性激素(P<0.05)。
DHEA是主要的促肾上腺激素，曾有报道指出DHEA转化为DHT失败是导致SS的关键原因[13]。成年女性外分泌腺80%的DHT来源于肾上腺的DHEA或DHEAS，20%来源于卵巢；在男性中，外分泌腺70%雄激素来源于睾丸直接分泌，25%的雄激素则来源于肾上腺分泌的DHEA[14]。女性绝经后卵巢退化，其雄激素主要来源于肾上腺分泌的DHEA的转化；老年男性的雄激素水平总体亦呈现降低趋势。在传统甾体激素代谢通路中，DHEA在17β-羟类固醇脱氢酶的作用下转化为雄烯二酮，之后3β-羟类固醇脱氢酶将其转化为T，T在5α-还原酶的催化下转化为DHT[15]。Luu-The等[16]于2010年提出了一个全新的性激素代谢途径，即外周组织来源的DHEA可以跳过T直接转化为E2及DHT，而这对绝经后的女性至关重要。本研究发现，在SS患者中，DHEAS的水平显著低于健康人，与报道的结果一致[8,9,17]。然而DHEA在治疗SS并没有如期效果[10,18]，推测DHEA未能转化为下游有活性的激素所致。本研究结果显示，SS患者血清样本中T的含量显著低于健康人，而雄烯二酮的含量在两类人中没有差异。Forsblad-d'Elia等[19]的研究表明，嘴干症状的SS患者与低水平的T及雄烯二酮呈正相关。Versura[20]等在综述干眼症与女性激素失衡关系中指出，绝经后女性T以及雄烯二酮是重要的激素前体物质，为该时期女性雌激素的重要来源。以上数据说明了T及雄烯二酮对SS女性的重要性，推测在本研究对象中，雄烯二酮转化为T的效率偏低是关键因素。
本研究还发现，绝经后SS女性体内有更多项的雄激素与绝经后的健康女性存在差异。多项雄激素的减少，可能是导致绝经后女性得病率比绝经前高的关键原因。由于样本数量的局限性，在接下来的工作中，要收集足够多的大样本来对本项研究予以验证，并对研究对象的具体症状进行细致分类，为SS的诊疗提供一个新的思路。
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