通过离子通道芯片及Western blot实验证实先天性巨结肠(Hirschsprung disease，HD)病变肠段的钾离子通道表达与正常的结直肠存在差异。
2012年8月到2013年12月在哈尔滨医科大学附属第一医院手术治疗先天性巨结肠患儿30例，通过病史、直肠测压、钡剂灌肠造影、术中冰冻及术后病理等确诊为HD，术中结肠切除完成后，分别取正常及病变狭窄段肠组织，大小为1.0 cm×1.0 cm；标本置入液氮中冻存以待进一步实验。取其中6组标本，应用人类神经离子通道PCR芯片(neuronal ion channels PCR array)进行筛选表达具有差异性的钾离子通道；全部30例标本应用Western blot检测所筛选出钾离子通道的表达情况。结果采用Image-Pro Plus魔棒选取蛋白条带，利用IOD算法计算条带灰度。
我们将表达变化在2倍以上的基因认定为是差异表达基因，从而通过芯片筛选出表达具有差异性的钾离子通道15个，其中无神经节肠段表达增强1个，表达降低14个，共包括电压门控性的钾离子通道9个、大电导Ca2＋激活的K＋通道2个、小电导Ca2＋激活的K＋通道2个、内向整流性钾离子通道2个。利用Western blot验证大电导Ca2＋激活的K＋通道的Maxi K通道及电压门控性钾离子通道的Kv11.1通道α亚基蛋白的表达。并经统计学分析，认定差异具有显著差异性。
先天性巨结肠结肠组织中确实存在表达下调的钾离子通道。
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先天性巨结肠(Hirschsprung's disease, HD)又称肠无神经节细胞症，是以结直肠内缺失神经节细胞为特征的胃肠动力性疾病，其病变肠段缺乏推进式运动，从而引起梗阻症状。HD病因复杂，尚未完全阐明，目前大多认为系遗传及环境多种因素综合作用、共同调控的结果[1]。
自上世纪90年代起，不断有学者对离子通道与HD的关系方面做了相关研究，推测结肠离子转运异常可能是形成的促发因素。有文献报道TEA可作用于K＋通道从而使十二指肠平滑肌产生收缩[2]。本实验通过钾离子通道的表达差异，来探讨其在HD发病中的作用，为探索无创、安全、有效的治疗新方法奠定实验基础。
2012年8月到2013年12月在中国哈尔滨医科大学附属第一医院手术治疗先天性巨结肠患儿30例，均根据病史、直肠测压、钡剂灌肠造影、术中冰冻及术后病理等确诊为先天性巨结肠。其中6例(2例短段型，4例常见型)，全部用于芯片实验。男4例，女2例，年龄2～5岁，平均3.3岁，无神经节肠段均为乙状结肠、直肠。全部30例用于Western blot实验。
于术前钡剂灌肠造影、术中肉眼所见及术中冰冻病理等证实患儿的无神经节肠段位于乙状结肠、直肠。在手术切除的肠段上分别取患儿的狭窄病变段肠管组织及正常段肠管组织(根据术中肉眼所见及术中冰冻病理)各2小块大小约为1.0 cm×1.0 cm(其中一对作为备用)，以生理盐水清洗干净切为小块，放入事先标记好的冻存管中(正常组织2管，病变组织2管)，然后立刻放入携带的小液氮罐中冷冻保存，注意登记患儿的相关信息并于患儿病理结果回报后进一步完善。所取下的组织冻存，准备进行用于下一步的芯片实验及Western blot实验。
芯片实验采用了康成生物有限公司所提供的人类神经离子通道芯片(Neuronal Ion Channels PCR Array)进行分析，对照组和处理组的样本分别重复6张芯片，共计12张芯片。Western blot实验采用美国Santa公司提供的兔抗人MaxiK及Kv11.1通道蛋白抗体，检测两种筛选出的通道蛋白表达情况。
芯片结果是通过倍数法(阈值法)来认定差异表达的离子通道基因，即运用倍数值来估计不同标本间每个基因的表达量的差异。根据信号强度的比值，在6对标本之间，表达变化在2倍以上的基因(即Ratio值小于0.5或大于2的基因)被认定为是差异表达基因。Western blot结果采用Image-Pro Plus魔棒选取蛋白条带，利用IOD算法计算条带灰度，使用SPSS 20.0软件的t检验的方法进行统计学的分析，并取P<0.05，认为差异具有统计学意义。
本研究采用人类神经离子通道芯片(Neuronal Ion Channels PCR Array)进行基因表达谱分析，其中短段型及常见型HD表达未见明显差异，筛选出差异性表达的钾离子通道共计15个，其中14个表达下调，1个表达上调(表1)。
离子通道与基因列表
离子通道与基因列表
| 离子通道名称 | 基因名称 | 倍数变化 |
|---|---|---|
| KCNA2 | HBK5, HK4, HUKIV, KV1.2, MGC50217, MK2, NGK1, RBK2 | 0.24 |
| KCNA5 | ATFB7, HCK1, HK2, HPCN1, KV1.5, MGC117058, MGC117059, PCN1 | 0.12 |
| KCNAB1 | AKR6A3, KCNA1B, KV-BETA-1, Kvb1.3, hKvBeta3, hKvb3 | 0.16 |
| KCNAB2 | AKR6A5, HKvbeta2, HKvbeta2.1, HKvbeta2.2, KCNA2B, KV-BETA-2, MGC117289 | 0.11 |
| KCNB1 | DRK1, KV2.1, h-DRK1 | 0.11 |
| KCNB2 | KV2.2 | 0.30 |
| KCNC2 | KV3.2, MGC138196 | 0.20 |
| KCNH2 | ERG1, HERG, HERG1, Kv11.1, LQT2, SQT1 | 0.09 |
| KCNJ2 | HHBIRK1, HHIRK1, IRK1, KIR2.1, LQT7, SQT3 | 0.21 |
| KCNJ5 | CIR, GIRK4, KATP1, KIR3.4, LQT13 | 4.95 |
| KCNMA1 | BKTM, DKFZp686K1437, KCa1.1, MGC71881, MaxiK, SAKCA, SLO, SLO-ALPHA, SLO1, bA205K10.1，mSLO1 | 0.19 |
| KCNMB4 | － | 0.26 |
| KCNN2 | KCa2.2, SK2, SKCA2, hSK2 | 0.09 |
| KCNN3 | KCa2.3, SK3, SKCA3, hSK3 | 0.13 |
| KCNQ2 | BFNC, BFNS1, EBN, EBN1, EIEE7, ENB1, HNSPC, KCNA11, KV7.2, KVEBN1 | 0.18 |
Western blot实验检测离子通道蛋白表达的结果示Maxi K以及Kv11.1通道在HD标本表达均较正常组织下调。(图1)。
至今已确定结直肠平滑肌上存在多种类型的离子通道。目前已发现的通道有[1]：Ca2＋通道中的L-型Ca2＋通道、T-型Ca2＋通道；Ca2＋激活的Cl－通道；TTX敏感性钠离子通道；而钾离子通道在所有的离子通道中则占据了大多数：非电压依赖性钾通道中的小电导Ca2＋激活的K＋通道、ATP敏感K＋电流(KATP)、内向整流钾离子通道、G蛋白偶联内向整流钾离子通道、TREK-1通道以及具有电压依赖性的钾通道中的大电导Ca2＋激活的K＋通道、延迟整流K＋通道、A-型K＋通道、HERG通道等。
结合前人的研究，我们也看到了离子通道与先天性巨结肠的关联性：1993年，Hardy等[3]首次研究了剥除肌层后的先天性巨结肠患儿结肠黏膜离子转运的情况，其结果提示了神经损伤后，对离子转运的调节失常。Hosoda等[4]则于2000年提出巨结肠粪便排空困难与离子通道的变化相关联。徐纪荣等[5]于2005年的研究成果提示结肠上皮基础水平的电解质转运受神经支配，并推测结肠离子转运的异常可能是巨结肠形成的促发因素。Vanderwinden等[6]在2002年报道了小电导Ca2＋激活的K＋通道(SK)的亚型SK2、SK3在人类消化道肌层表达。随后，Piotrowska等[7]在2003年首次报道SK2和SK3的通道在正常的人体结肠高表达，且在无神经节的肠道中，SK3通道表达有明显下降，而SK2通道并不明显下降，其中SK3特别存在于ICC中。无神经节肠道缺乏ICC的表达可导致先天性巨结肠运动功能障碍。
在本研究中我们应用了人类神经离子通道芯片(neuronal ion channels PCR array)，并采用ΔΔCt方法进行数据的分析，筛选出差异性表达的钾离子通道，芯片分析的结果显示：共计有15个离子通道差异性表达，其中14个表达下调，1个表达上调。共包括电压门控性的钾离子通道9个、大电导Ca2＋激活的K＋通道2个、小电导Ca2＋激活的K＋通道2个、内向整流性钾离子通道2个。Western blot实验的结果也进一步证实了离子通道的蛋白表达异常。这些结果提示我们之前所作的猜想是正确的：HD病变段离子通道的数量与正常结直肠确实存在着差异性，而且大部分病变段的离子通道数量的表达下调。
电压门控性钾(voltage-gated K＋channels，Kv)离子通道是一类受膜电压调节的钾离子通道的总称。它广泛存在于多种组织的多种细胞膜上，参与细胞电冲动的发放还有内分泌的相关调节。功能性的Kv通道是由4个α亚基与若干个辅助亚基共同组成的。关于通道激活以及失活的相关机制目前还没有完全的被阐明。并且对于不同的离子通道来说，激活与失活的机制也不尽相同。有报道慢性心房颤动患儿的Kv4.3离子通道的mRNA为下调[8]。
大电导Ca2＋激活的K＋通道(large conductance，Ca2＋-activated K＋ channels)是钾离子通道中最为复杂的一类，其通道是由a亚基与b亚基组成四聚体结构，其中a亚基是孔道形成单位，而b亚基是调控单位。a亚基共有四型，其中b1亚基主要分布于平滑肌细胞上。该离子通道广泛地表达于兴奋和非兴奋细胞中，并参与了许许多多的生理过程，譬如动作电位的形成，促进分泌激素以及促进肌肉的松弛等。
大电导Ca2＋激活的K＋通道的特殊性主要在于其门控特性，也就是说它既能被跨膜电位调控，而且还能被细胞内Ca2＋调控，更为神奇的是它还可以反过来反馈调节细胞内Ca2＋浓度，但是这两者并不具有明显的耦联。除此之外，大电导Ca2＋激活的K＋通道还可以被化学因子进行调控，还有膜应力也可以对其进行调控。它具有精细的细胞生理功能调节机制和较为广泛的生理意义。其离子通道阻断剂有：四乙铵(TEA)、黄蝎毒素、IBTX等[9]。
近年来，大电导Ca2＋激活的K＋通道一度成为国内外研究的热点，并且它在多种组织及疾病的研究中均有贡献，如逼尿肌平滑肌细胞[10,11,12]、支气管平滑肌细胞[13,14]、子宫平滑肌细胞[15]、心血管平滑肌[16,17]等，且分子机制十分复杂。而在先天性巨结肠方面，对大电导Ca2＋激活的K＋通道的认识不清。
在结肠平滑肌中，大电导Ca2＋激活的K＋通道分布密集，其在平滑肌收缩性的调节过程中具有重要作用。有报道BK通道的活动受结肠环形平滑肌炎症因子的调控[18]。Matthias等[19]在研究小鼠末端结肠BK通道影响K＋分泌时提出BK通道在跨上皮电压及静息膜电位的变化方面起到重要作用。France等[20]新近研究则证实：BK通道在小鼠末端结肠平滑肌细胞起到重要的作用，而非近端结肠。在我们的实验中取自人类末端结肠组织的BK通道表达是下降的，进一步佐证了我们的观点。
通过本研究，我们通过芯片筛选出在人类HD患儿病变肠段差异表达的钾离子通道，并验证了其中两种钾离子通道的蛋白水平表达情况，表达水平均下调，证明钾离子通道的表达与HD的发病相关。本实验的局限性在于，离子通道PCR芯片的实验结果，我们仍需要谨慎对待，在许多方面上可发生基因的表达调控，mRNA水平的变化有时不能完全反映蛋白质的水平，以及对蛋白质的功能情况，也无法完全阐明，虽然对其中两个通道进行了Western blot实验进行验证，但下一步课题组还需要进一步全面的对每种表达具有差异性的钾离子通道从蛋白水平、转录调控水平进行验证。先天性巨结肠其真正的发生机制仍需要深度的发掘研究。
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