巨噬细胞具有丰富的生理功能，与多种疾病有关。作为一类重要的固有免疫细胞和抗原提呈细胞，在机体抗感染免疫中发挥着重要作用。上世纪末本世纪初免疫学家发现巨噬细胞在不同的诱导因素下可极化为具有不同表型和功能的亚型，主要分为促炎型巨噬细胞(M1型)和抗炎型巨噬细胞(M2型)。M1、M2型巨噬细胞极化涉及不同的转录因子，调控不同的目的基因表达而发挥相应的生理学功能，是对巨噬细胞功能认识的更新。新生儿坏死性小肠结肠炎是新生儿时期常见的一种炎症性、免疫性疾病，在早产儿及极低出生体重儿中发病率更高，接近15%，病死率高达50%。NEC是肠道发育不成熟、肠道菌群异常定植、肠道缺血缺氧及喂养不当等综合因素相互作用的结果，具体发病机制不清楚，目前尚无特异性的防治手段。研究发现单核细胞和(或)巨噬细胞参与新生儿坏死性小肠结肠炎的病理过程，通过诱导巨噬细胞的极化，促进巨噬细胞向M2型极化，从而减少促炎因子的合成而表达抗炎性细胞因子，下调炎症反应，降低NEC发生率及疾病的严重程度，可能为NEC的治疗提供一种新的思路。
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巨噬细胞是一种异质性和可塑性较强的细胞，在固有免疫、适应性免疫，组织修复与重塑过程中发挥重要作用。多种刺激因子可使其分化为不同表型的亚型，履行不同的生物学功能[1]。极化后的巨噬细胞在炎症、免疫调节、组织修复与重塑、肿瘤及物质代谢方面发挥不同的作用[1,2]。巨噬细胞参与炎症性疾病如NEC的发展及转归，对其治疗具有重要意义[3]。
巨噬细胞是血液单核细胞穿出血管进入结缔组织分化形成的，广泛分布于机体。单核细胞和中性粒细胞具有共同的造血祖细胞，经过原单核细胞和幼单核细胞变为单核细胞[4]。幼单核细胞增殖能力很强，当机体出现炎症或免疫功能活化时，幼单核细胞加速分裂增殖，以提供足够的单核细胞，在血液中仅停留12～48 h，进入表皮棘层，可分化为朗格汉斯细胞；进入结缔组织或器官，可分化为巨噬细胞。
巨噬细胞在不同的微环境经不同的刺激因子诱导可发生差异性的活化，分化为具有不同功能表型的亚型，而发挥不同的生物学功能。根据极化后细胞表面标示性分子及功能的不同，巨噬细胞主要分为两种类型：经典激活型巨噬细胞(classically activated macrophage ，M1型)和替代激活型巨噬细胞(alternatively activated macrophage，M2型)[1,5]。巨噬细胞极化的过程是可逆的，M1型和M2型只是极化过程中的两个极端，巨噬细胞可存在于这一极化过程中的任何状态，但巨噬细胞极化的具体机制仍不完全清楚[6,7,8]。(表1)
M1和M2型巨噬细胞的极化
M1和M2型巨噬细胞的极化
| 类型 | 刺激因子 | 转录因子 | 细胞因子 | 趋化因子 | 标志物 | 代谢 | 功能 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| M1 | IFNγ、LPS | STAT1/STAT2、STAT5、IRF3、IRF5、NF－κB、AP－1 | IL-1、IL-6、IL-12、IL-15、IL-23、ROS、TNFα | CCL8/15/19/20、CXCL10/11/13/19 | CD16/32、CD86、MHCⅡ、iNOS | iNOShigh、ferritinhigh、ferroportinlow | Proinflammatory、Microbicidal、Anti-tumoral、Insulin resistance |
| M2 M2a | IL-4 OR IL-13 | JMJD3、IRF4、PPARγ、STAT6 | TGFβ、IL-10、IL-1Ra、PDGF | CCL13/14/17/18CCL22/23/24/26 | Arg-1、CD163、SR、MR、YM1、FIZZ1 | Arg-1high、ferritinlow、ferroportinhigh | Anti-inflammatory、Immunoregulation、Tissue remodeling、Proliferation、Protumoral、Insulin sensitive |
| M2b | IC、IL-1β、LPS | — | IL-10、TNFα、IL-1β、IL-6 | CCL1/20CXCL1/2/13 | IL-10high、IL-12low、MHC-Ⅱ、CD163、CD86、 | — | — |
| M2c | IL-10 | — | IL-10、TGFβ | CCL16/18CXCL13 | Arg-1、CD163、SR、MR | — | — |
注：M1：经典激活型巨噬细胞；M2：替代激活型巨噬细胞；MR：mannose receptors(CD206，甘露糖受体)；SR：scavenger receptors(CD204，清道夫受体)；YM1：chitinase 3-like3(chi3l3，类几丁质酶3)；FIZZ1：resistin-like-α(Retnla，类抵抗素α)；NOS2：Nitrc oxide synthase2(iNOS，诱导型一氧化氮合成酶)；Arg-1：arginase1(精氨酸酶)；IRF：Interferon regulatory factor(干扰素调节因子)；STAT：Singal transducer and activator of transcription(信号转导和转录激活子)；PPAR：Peroxisome proliferator activated receptor(过氧化物酶增殖激活受体)；LPS：Lipopolysaccharide(脂多糖)；JMJD：Jumonji domain(jmjd结构域)
M1型巨噬细胞主要由LPS和(或)IFN-γ刺激诱导产生，表达CD16/32、CD86、MHC-Ⅱ、DCSIGN(Denddritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin 1，CD209)等膜蛋白，分泌IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、TNF-α等促炎因子，同时分泌CCL8、CCL15、CXCL10、CXCL19等趋化因子[5,9]。对精氨酸及铁代谢有调节作用：高表达iNOS，合成大量的NO[10]；促进铁的吸收[11,12]。STAT1、IRF3、NF-κB及AP-1等转录因子参与M1型巨噬细胞的极化[9]。M1型巨噬细胞主要参与Th-1型免疫应答，并具有杀伤病原体和肿瘤细胞的作用[2]。
NF-κB是一类普遍存在于各种细胞内重要的核转录因子，生理情况下以无活性的形式存在于胞质中，广泛参与机体对于外界刺激产生应答的信号通路中。NF-κB过度激活可导致多种炎性细胞因子的生成，如TNFα、IL-1β、IL-6等。有研究表明[13]，IKKβ调节NF-κB活性，在应答炎症、免疫反应时具有异质性，IKKβ-/-气道上皮细胞中表现M2型，而在巨噬细胞则表现M1型，说明IKKβ在巨噬细胞极化过程中起到关键作用，IKKβ抑制巨噬细胞的M1型极化。肿瘤相 关巨噬细胞内NF-κB信号通路是维持其功能的主要机制。在Ikkβ-/-小鼠中发现，巨噬细胞IL-12、NOS2、MHCⅡ等M1型促炎因子表达上升，而IL-10、Arg-l表达下降，说明Ikkβ活化NF-κB可抑制巨噬细胞向M1型极化而促进其M2型极化[13]。Porta等[14]研究发现，NF-κB中的P50亚基参与巨噬细胞的极化，P50-/-鼠M2型极化受阻，促使巨噬细胞的M1型极化。人源巨噬细胞中IRF5呈可塑性表达，在M1型巨噬细胞高表达，并直接诱导M1型巨噬细胞促炎因子IL-12、IL-23高表达而抑制抗炎因子IL-10转录，调控巨噬细胞的M1型极化，同时IRF5能促进Thl-Thl7反应[15]。此外，IRF家族中IRF1是M1型巨噬细胞极化中的重要中间介质，能协同NF-κB的活化，促进促炎细胞因子的分泌，同时具有抑制IRF4调控的M2型极化功能[16]。
M2型巨噬细胞是非经典激活途径的统称，而依据不同的诱导因素而分为M2a、M2b、M2c、M2d等。M2a主要由IL-4和(或)IL-13诱导产生，高表达TGFβ、IL-10、PDGF等细胞因子和CCL13/14/17/18等趋化因子，以Arg-1、CD163、Fizz-1(类抵抗素α)，YM-1(类几丁质酶3)、SR(Scavenger receptors)，及MR(Mannose receptors)等为膜蛋白标志物[17,18]。M2b由IC(免疫复合物)、IL-1β、LPS等诱导产生，高表达IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子和CCL1/20、CXCL1/2/13等趋化因子以高表达MHC-Ⅱ、CD163及CD86为特点。M2c由IL-10诱导产生，分泌IL-10及TGFβ等细胞因子和CCL16/18、CXCL13等趋化因子[19]。JMJD3、IRF4、PPARγ、STAT6等转录因子参与M2型巨噬细胞的极化[9,20]。低表达iNOS而高表达Arg-1，调节精氨酸代谢，减少NO的生成，增加铁的释放[11,12,21]。不同亚型的M2型巨噬细胞具有不同的功能，主要参与体内平衡过程，如血管再生、组织重塑、伤口愈合等。
Ikkβ活化NF-κB使巨噬细胞的向M2型极化，IKKβ抑制剂促进肿瘤相关巨噬细胞的M2型向M1型极化，从而抑制肿瘤的生长及转移[22]。Satoh等[20]通过JMJD-/-研究发现，JMJD3(Jumonji domain)在M1型巨噬细胞极化中的作用不明显，却直接调控巨噬细胞的M2型极化，是M2型巨噬细胞极化必不可少的。而IRF4是JMJD3调控M2型巨噬细胞极化的关键转录因子。过氧化物酶体增殖剂激活受体PPAR(peroxisome proliferators-activated receptors)是核激素受体家族中的配体激活受体，参与M2型巨噬细胞极化过程。M2型巨噬细胞膜表面分子与PPARs表达量正相关，PPARγ激动剂可促进人源单核细胞向M2型巨噬细胞分化[23]。PPARγ是M2型巨噬细胞分化成熟的关键因子，在PPARγ失活的骨髓细胞，显示M2型巨噬细胞极化受阻[24,25]。在PPARδ-/-小鼠中发现同样会促进机体的炎症反应，抑制巨噬细胞M2型极化[24]。
新生儿坏死性小肠结肠炎是早产儿及极低出生体重儿最常见的肠道炎症性疾病，发病率达15%甚至更高，病死率近50%[26]，目前尚无特异性的诊断指标。现普遍认为NEC是一种多种因素导致的疾病，主要与肠道发育不成熟、肠道菌群异常定植、肠道缺血缺氧及喂养不当等多种因素综合作用相关，但其具体的发病机制仍不完全清楚。由于NEC的起病隐匿、进展迅速，即使临床医生的早期干预，该病的死亡率依然居高不下，幸存患儿有神经系统发育迟缓、短肠综合征等并发症可能。
MohanKuma等[27]小组最近研究表明，在NEC患儿及三硝基苯磺酸诱导的小鼠肠炎模型中病变肠管标本检测发现末端回肠及结肠富集大量炎性细胞，其中主要为巨噬细胞和少量中性粒细胞，而无淋巴细胞，骨髓单核细胞趋化因子CXCL5在病变组织中高表达，说明巨噬细胞参与肠粘膜损害的病理过程。在Cronobacter sakazakii(CS)诱导的NEC模型中，通过小鼠腹腔分别注射Gr-1抗体和Carrageenan敲出多形核白细胞及巨噬细胞，发现血浆TNF-α，IL-1β，IL-12 and IL-6等细胞因子、iNOS及上皮细胞凋亡程度明显增加，恶化CS诱导的NEC[3]。
研究表明，肠屏障由机械屏障、微生物屏障及免疫屏障组成。早产儿胃肠道免疫屏障发育不成熟，直至生后3～4周，新生儿肠道B细胞和T细胞数目才能接近成人水平[28]。巨噬细胞作为一种重要的固有免疫细胞和抗原提呈细胞，在机体抗感染免疫中发挥着重要作用，如新生儿坏死性小肠结肠炎，本课题组前期实验已证实降低肠壁组织中炎症水平并维持肠黏膜的完整性可减少NEC的发生[29]。
Wei等[30]小组进一步研究发现，M1型巨噬细胞促进肠上皮细胞凋亡，而M2型作用却相反，HB-EGF(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor)通过使促炎型M1型向抗炎型M2型转化，减少炎症因子的合成，从而降低NEC的发生率。Anand等[31]研究发现，由IFN-γ活化的巨噬细胞通过NO依赖途径可以调节肠上皮细胞间的连接子蛋白(Cx43)磷酸化程度，影响上皮细胞之间的紧密连接。同时，Leaphart等[32]小组发现连接子蛋白Cx43介导的缝隙连接参与上皮细胞间的通讯交流，可调节上皮细胞的迁移能力。IFN-γ抑制Cx43磷酸化，明显降低上皮细胞的迁移能力。NEC患儿血清中IFN-γ水平升高，而IFN-/-小鼠NEC发病率明显降低。
Remon等[33]研究发现极低出生体质量NEC患儿血清中单核细胞绝对值较喂养不耐受患儿明显降低，据此可鉴别喂养不耐受与NEC患儿。近几年的研究发现某些特异性肠道相关蛋白，如肠脂肪酸结合蛋白[34]在新生儿NEC诊断中具有意义。调节M1/M2的比值，控制疾病的发生与发展，研究发现M2型巨噬细胞可以缓解横纹肌溶解引起的急性肾损伤[35]，并对急性肺损伤提供保护作用[36]。通过外界因素调节M1/M2的比值，为治疗NEC提供新的方向。
综上所述，巨噬细胞是一类具有丰富免疫作用的细胞。巨噬细胞参与多种疾病的发生与发展，巨噬细胞的极化在疾病的转归中作用更明确。巨噬细胞极化在动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等疾病中展开深入研究，但在新生儿疾病中的研究目前并不多。在新生儿坏死性小肠结肠炎的发病过程中，巨噬细胞极化可能起重要作用，因而研究巨噬细胞极化与NEC的关系可能成为治疗NEC的新思路。
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