对一个三代四人发病的DDH家系进行研究，以期发现与DDH发病相关的致病基因或易感基因。
对一个三代四人发病的DDH家系中的3个DDH患者和2个健康成员的血液样本进行全外显子测序并对测序结果进行生物信息学分析。采用Sanger测序验证分析获得的致病候选变异在其他可获得血液样本的家系成员中突变情况。
外显子测序结果经过生物信息学分析后发现有2个基因可能与DDH的发病有关：①骨形成蛋白2诱导激酶基因(bone morphogenic proteins-2-inducible kinase gene，BMP2K)中存在的改变蛋白修改功能的多核苷酸缺失/插入突变(c.1432_1440delCAGCAGCAG, p．Gln478_480del或c.1440_1441insCAG, p．Gln480ins)，该突变位于第4号染色体第11外显子。②前列腺素F2α受体基因(prostaglandin F2α receptor，PTGFR)中存在的终止密码子突变(c.C922T, p．R308X)，该突变位于第1号染色体PTGFR基因的第2/4外显子。DDH患者和具有潜在突变携带可能的正常母亲血液样本中均有BMP2K和PTGFR突变，而作为对照的正常姐姐的血液样本中没有BMP2K和PTGFR突变。Sanger测序验证结果显示，家系中的全部4例DDH患者(100%)和有血缘关系的12例正常家系成员中的3例(25%)存在BMP2K基因的杂合突变和PTGFR的终止密码子突变，而8例无血缘关系的正常家系成员无BMP2K基因和PTGFR基因突变。
研究结果提示BMP2K基因的杂合突变和PTGFR的终止密码子突变可能是导致该家系DDH发病的致病基因或易感基因。结合家系的宝贵遗传信息和二代测序的高效、高通量技术是发现与DDH发病相关的致病位点的有效途径。
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发育性髋关节脱位(developmental dysplasia of the hip，DDH)是儿童骨科最常见的疾病之一。DDH在中国的发病率为5‰，在国外为2‰～50‰不等，以女性占绝对优势，男女比为1：4.75，发病率在人种和地区间差异明显，白种人最高、黄种人次之，这与遗传因素、环境影响和生活习惯相关[1,2]。DDH是股骨近端和髋臼的解剖结构异常而导致的髋关节半脱位或脱位和功能障碍，该病可轻至髋臼发育不良、重至严重丧失关节功能，甚至部分患儿在成人期因严重的骨关节炎而不得不接受全髋关节置换方能缓解疼痛、改善功能[3]。目前为止，DDH的发病是遗传和环境因素共同作用的结果的观念已被国内外研究者和临床工作者所认同，但DDH的明确致病基因和发病机制仍不清楚[2,4,5,6,7,8,9]。目前的手段很难在新生儿期甚至胎儿期筛查DDH患儿，特别是髋关节轻微异常的DDH患儿更难发现[2,10]。因此，采用基因或生物标记手段筛查新生儿期甚至胎儿期的DDH患儿将能大大提高DDH患儿检出率，使DDH患儿获得早期诊断和治疗。本研究通过对DDH家系进行全外显子测序和家系内验证，以期发现与DDH发病相关的致病或易感基因。
本研究于2014年1月招募了1个中国安徽省的DDH家系，该家系共3代4例患者(图1)。其中，女性3例，男性1例，平均发病年龄2.6岁。先证者(IV6)出生后16个月开始独立行走，此时即发现步态异常，自行观察6个月后步态异常无好转并就诊，否认下肢外伤史及感染病史，入院后体检见步态跛行；双下肢不等长，左下肢较右下肢短缩1.5 cm，左侧髋关节外展试验(＋)，Allis征(＋)，左侧Trendelenburg征(＋)；前后位骨盆X线平片提示左侧股骨头位于髋臼外上方，左侧股骨头发育落后，左侧髋臼浅平，左侧Shenton线不连续，左侧髋关节脱位诊断明确。
注：黑色填满：DDH患者；反斜线标记：已经去逝的家系成员；*：能获得DNA样本的家系内成员；exome：进行全外显子测序分析的家系内成员；箭头：先证者
Perkin方格，正常时股骨头位于内下区，超出内下区方格者视为DDH异常；髋臼指数，正常为20°～25°，异常为>30°；Shenton线，连续性良好表示髋关节对位良好，连续性破坏视为异常；中心边缘角<15°视为异常。
体格检查和影像学评估由3个儿童骨科医师完成，有异议者增加2位儿童骨科医师进一步评估，所有患者均没有系统性疾病。在获得所有参与人或其法定监护人的书面知情同意后，家系成员通过仔细的体格检查和前后位髋关节X线平片检查，采取获得知情同意书签字的24位家系成员的外周静脉血。收集和使用病患生物样本均通过上海市儿童医院伦理委员会审核。
根据厂家实验步骤对获得的24例家系成员2 ml外周血样本进行基因组DNA抽提(QIAamp DNA Blood Mini Kit，Cat .No.51104，德国)，琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA污染，应用Nanodrop 2000/2000c分光光度仪检测DNA纯度(OD260/280比值)，应用Qubit对DNA浓度进行精确定量，记录样品纯度和浓度后－80 ℃冰箱储存备用。
选择3例DDH患者(Ⅳ6、Ⅲ3和Ⅲ10)和2例无DDH的家庭成员(Ⅲ2、Ⅱ7)进行全外显子组测序(图1)。其中Ⅲ2作为正常对照者，Ⅱ7作为致病/易感突变的携带者。方法1中抽提的DNA OD值在1.8～2.0之间、含量在1.5 μg以上的基因组DNA样品建库。基因组DNA建库和目标区域捕获采用Agilent SureSelect Human All ExonV5试剂盒(安捷伦科技有限公司，纽卡斯尔，美国)根据生产方说明书严格操作，全外显子区域DNA高效富集并捕获后经PCR线性扩增后进行文库质检，质检合格的样品外显子文库通过Illumina HiSeq 2500测序平台(Illumina，San Diego，California，USA)根据标准程序上机进行高通量、高深度测序。统计各样品Illumina原始下机测序序列(Reads)的测序生成数据量、平均测序深度、覆盖度等数据，使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)进行标准序列比对，对照参考序列或参考基因组来源于千人基因组(http：//www.1000genomes.org)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)的第37版人类基因组序列(GRCh37)，比对后的数据进行GATK基因型分型分析(Broad Institute Genome Analysis Tool Kit，GATKv2.6)，以ANNOVAR 11和SnpEff注释变异，以Exome Depth检测CNV[11,12,13]。过滤掉不影响基因功能的同义突变、公共遗传突变数据库(dbSNP137数据库、千人基因组数据库和美国国家心肺血液研究数据库(NHLBI)中正常人携带的常见突变，最后选取Ⅳ6、Ⅲ3、Ⅲ10和Ⅱ7共有并且Ⅲ2没有的变异作为候选致病突变。再应用UCSC生物信息资源数据(http：//genome.ucsc.edu/)查询候选致病基因的碱基序列、编码蛋白质序列；应用genegard(http：//www.genecards.org/)查询蛋白质表达部位；应用OMIM(http：//omim.org/)和NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)分别查询蛋白的结构及功能；应用SIFT(http：//sift.jcvi.org/)和Polyphen2(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)预测候选基因序列变异所导致的氨基酸改变是否造成蛋白质功能损害。
经过基因功能分析，筛选出最有可能的候选致病基因，通过PCR扩增及Sanger测序方法，对家系内4例DDH患者和其他可获得的20例无DDH的亲属进行该位点的突变检测，验证这一突变是否与疾病共分离。
本研究对3例DDH患者和2例家系内无DDH成员进行了全外显子测序分析。每例样本测序得到的原始测序序列(raw reads)进行精细过滤后平均获得1.597 4亿100 bp的双端测序序列(clean reads)进行后续生物信息学分析，目标区域覆盖度为98.8%，96.6%目标区域测序深度>20×。表1中的数据提示全基因组外显子捕获成功，测序质量可靠。以上数据进一步利用GATK分析SNP信息，每例测序样本平均捕获38 810个SNP(36 493～40 633)，168个杂合突变中有92.8%已在dbSNP v137公共数据库被注释。3例DDH及视为突变携带者的先证者的祖母(图1中的Ⅳ6、Ⅲ3、Ⅲ10和Ⅱ7)共有，且被视为正常对照者的先证者的姨(图1中的Ⅲ2)所没有的变异，作为候选致病突变。这些突变包括：错义突变、无义突变和插入缺失突变。为了精炼我们的突变列表，我们最后筛选获得dbSNP137数据库、千人基因组数据库和NHLBI数据库均未报道过的插入缺失变异或SIFT和ANNOVAR预测为功能有害的变异[14,15]。
外显子测序数据汇总
外显子测序数据汇总
| 样本 | Ⅳ6 | Ⅲ3 | Ⅲ10 | Ⅱ7 | Ⅲ2 |
|---|---|---|---|---|---|
| 目标区域配对读数百分比(%) | 84.89 | 85.93 | 85.66 | 85.87 | 86.59 |
| 目标区域配对读数在±150 bp范围内的百分比(%) | 85.39 | 86.42 | 86.16 | 86.29 | 86.38 |
| 目标区域配对读数在±500 bp范围内的百分比(%) | 86.08 | 87.08 | 86.82 | 86.49 | 87.28 |
| 目标区域平均测序深度 | 108.15 | 146.38 | 171.93 | 168.26 | 149.33 |
| 总的目标区域 | 185 636 | 185 636 | 185 636 | 185 636 | 185 636 |
| 被覆盖的目标区域百分比(%) | 99.96 | 99.86 | 99.87 | 99.94 | 99.86 |
| 总的目标碱基数(个) | 51 189 318 | 51 189 318 | 51 189 318 | 51 189 318 | 51 189 318 |
| 覆盖至少1×目标碱基的百分比(%) | 99.92 | 99.85 | 99.86 | 99.96 | 99.90 |
| 覆盖至少5×目标碱基的百分比(%) | 99.49 | 99.60 | 99.66 | 99.82 | 99.73 |
| 覆盖至少10×目标碱基的百分比(%) | 98.48 | 99.08 | 99.24 | 99.64 | 98.86 |
| 覆盖至少20×目标碱基的百分比(%) | 94.79 | 97.16 | 97.79 | 97.65 | 96.62 |
| 覆盖至少30×目标碱基的百分比(%) | 89.25 | 94.09 | 95.47 | 94.86 | 95.08 |
| 覆盖至少50×目标碱基的百分比(%) | 75.26 | 85.35 | 88.68 | 86.26 | 87.34 |
外显子测序结果经过方法2中描述的系列生物信息学方法过滤筛选，最后剩下2个基因的突变可能与该家系DDH发病最相关。一个是骨形成蛋白2诱导激酶基因(bone morphogenic proteins-2-inducible kinase gene，BMP2K)中存在的改变蛋白功能的多核苷酸缺失或插入突变(c.1432_1440delCAGCAGCAG，p.Gln478_480del或c.1440_1441insCAG，p.Gln480ins，图2)，该突变位于第4号染色体BMP2K基因第11外显子；另一个是前列腺素F2α受体基因(prostaglandin F2α receptor，PTGFR)中存在的终止密码子突变(c.C922T，p.R308X，图3)，该突变位于第1号染色体PTGFR基因第2/4外显子。3例DDH及视为突变携带者的先证者的祖母的血液样本中均存在BMP2K和PTGFR的突变，而作为正常对照的DDH先证者的阿姨的血液样本中没有BMP2K和PTGFR的突变。
注：红色箭头：突变位点所在位置显示杂合双峰
注：红色箭头：突变位点所在位置显示杂合双峰
Sanger测序示，家系中全部4例DDH患者(100%)和12例有血缘关系中无DDH的3例(25%)血液样本中存在BMP2K基因的杂合突变(Ⅱ1、Ⅱ2和Ⅱ9)和PTGFR的终止密码子突变(Ⅱ1、Ⅱ2和Ⅱ9)，而家系中无血缘关系无DDH的8例无BMP2K基因和PTGFR基因的突变。
DDH病因学复杂，越来越多的研究显示环境因素和遗传因素共同参与DDH的发病。环境因素包括宫内(羊水过少)、产时(臀产位)、初次产和产后(襁褓方法不当)等[10]。流行病学研究显示，遗传因素在DDH的发生中起重要作用，67.88%的DDH的发病与遗传因素有关[16]。同卵双生DDH的发病一致率(41.4%)远远高于异卵双生的发病一致率(2.8%)；DDH先证者一、二级亲属DDH患病率显著高于对照组(高12倍)，先证者二级亲属的患病率(0.45%)显著低于一级亲属(2.68%)而不是降低1/2或1/4[17]。包括家族聚集性研究、家系的复合分离分析、遗传模式分析和流行病学调查在内的多种研究结果也表明孤立型DDH符合常染色体显性遗传的一些特性，但不表现为简单的孟德尔方式遗传，可能由于其复杂的病因，DDH往往表现为不完全外显性[5,7]。这些证据都提示DDH有明显的遗传倾向，本文即在此背景下对DDH家系成员进行全外显子测序和候选突变家系成员中验证，探索DDH的发病机制。
近10年，DDH发病的遗传学基础被越来越多的研究所证实。基于家系的连锁分析、基于核心家系的传递不平衡检验、全基因组测序、全外显子测序、临床病例候选基因对照关联分析等方法是目前研究遗传因素在DDH发病中作用的主要手段。2006年，Mabuchi等[4]对一个髋臼脱位的日本家系进行全基因组测序发现与染色体13q22有关联，该课题组提出PCDH9、DACH、CDH1等与骨、关节发育相关的基因编码于该区域，但该研究组未在该区域发现致病性突变。2010年，李连永等[5]对103个DDH核心家系进行连锁不平衡分析和微卫星标记，首次将DDH的致病突变定位于17q21.31～17q22，他们提出HOXB9和COL1A1是包括在该区域的DDH候选易感基因。同年，Feldman等[6]通过对1个DDH家系的全基因组扫描研究，发现在染色体17q21.32的4.0 cM区域可能与DDH相关联。该区域与李连永等[5]所定位的区域重叠，进一步支持了在该区域内可能存在DDH易感基因或致病基因。Feldman等[8]结合连锁分析和全基因组外显子测序技术发现染色体3p38.7-41.31的2.61 Mb候选区域内的CX3CR1基因rs3732378位点存在C>T突变，认为该突变与DDH发病密切相关，但通过家系内验证发现家系内无血缘关系无DDH的人-配偶也存在该位点的突变，他们提出该位点的突变是该家系DDH发病所必须的，但该突变不足以导致DDH的发生。Li等[9]通过DDH病例对照研究进一步证实CX3CR1基因突变与中国人群的DDH发病相关。2015年，Watson等[18]发现Beukes髋关节脱位患者4q35区域的UFSP2基因存在c.868T>C；p.Tyr290His突变与Beukes家族髋关节脱位发病相关。2017年，Basit等[19]通过全基因组及全外显子测序发现HSPG2基因和ATP2B4基因的突变与DDH家系发病相关。本研究通过对一个三代间遗传的DDH家系进行全外显子测序、生物信息学分析和家系内Sanger测序验证，发现BMP2K基因和PTGFR基因中存在的未曾报道的新突变可能与该家系DDH发病相关，可能是该家系DDH发病的遗传基础，增加了DDH发病相关基因谱。DDH发病相关因素复杂，既与环境因素相关，又有遗传因素参与，且以不完全显性方式遗传。DDH的不完全显性遗传特征解释了本研究未患病家系内亲属(Ⅱ2、Ⅱ7和Ⅱ9)携带BMP2K和PTGFR突变这一结果。同时，本研究结果还显示BMP2K和PTGFR的突变出现在同样的家系成员中，这提示BMP2K和PTGFR可能通过相互作用影响DDH的发病。
骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是TGF-β超家族中的多功能细胞因子。BMP2是临床研究最多的BMP家族成员，在胚胎、胎儿及婴儿等阶段正常的骨骼发育和成骨细胞分化中发挥核心调控作用[20]。BMP2必须绑定至成骨细胞表面的BMP丝氨酸/苏氨酸激酶受体才能发挥其对信号通路的调控作用[21]。BMP2K即是BMP2的诱导激酶受体，BMP2K位于第4号染色体的q21.21，由Kearns等[22]于2001年首次克隆、鉴定。BMP2K编码蛋白是具有核定位信号的126 kDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，蛋白通过核定位信号直达胞核，因此它可能影响靶基因的转录过程。研究发现在BMP2诱导鼠成骨细胞分化过程中，BMP2K蛋白表达明显增加[21]。进一步的体外实验证实BMP2K可能通过蛋白激酶相关信号通路，降低碱性磷酸酶活性、降低骨钙素mRNA转录、影响骨矿物沉积等途径调控成骨细胞分化，研究证实BMP2K是细胞分化过程的重要调控因子[23,24]。近年，功能研究发现冲击波刺激原代培养的成骨细胞增殖和分化的同时也诱导BMP2K的表达增加；MC3T3-E1骨母细胞稳定表达BMP2K的同时抑制成熟成骨细胞的分化功能，以调控成骨细胞转录并参与胎儿和婴儿骨发育的1，25-羟维生素D处理细胞可降低成骨细胞中BMP2K蛋白的表达[25,26]。这些研究结果均提示BMP2K在成骨细胞增殖和分化，在胚胎胎儿期和婴幼儿期正常的骨骼和关节发育中发挥重要调控作用。因此，本研究中发现的BMP2K的新突变可能影响髋关节的发育，从而导致DDH的发生。
软骨内成骨贯穿于正常骨关节生长、发育和外伤后骨骼修复，软骨内成骨的软骨细胞分化过程受到多种生长因子和信号分子调控，其中一类信号分子即是前列腺素(prostaglandins，PGs)，PGs是一组化学结构相似、具有广泛生物活性的不饱和脂肪酸，PGs家族包括PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2和TXA2。体内的PGs含量极微，但活性极强。PGs调节软骨新陈代谢并参与骨关节炎和类风湿性关节炎的形成，除PGE2外，PGF2α是关节液的主要前列腺素，骨关节炎和类风湿性关节炎病人血液和关节液中的PGE2和PGF2α水平均明显增高[27]。PGF2α能刺激鼠软骨细胞株聚糖蛋白合成并促进人关节软骨细胞中二型胶原蛋白mRNA的表达[28,29]。PGF2α通过其受体PTGFR发挥生物学作用，PTGFR属于G蛋白偶联受体(GPCRs)，PGF2α与PTGFR结合，活化的PTGFR属于Gq蛋白，Gq增加肌醇三磷酸/甘油二酯(IP3/DAG)水平，从而激活蛋白激酶C(PKC)、触发Ca2＋从细胞内质网释放，接着PKC激活PI3K、细胞外信号受体激酶(ERK)、P38和NFkB信号通路，激活细胞内的信号转导系统及基因转录从而发挥调控作用[30]。Wang等[31]发现PTGFR mRNA表达于软骨生长版的肥大软骨细胞，这提示PTGFR-PGF2α信号通路可能参与软骨细胞的肥大过程。Kim和Shim[32]发现PTGFR的表达在软骨形成后期明显增高，低表达PTGFR干扰软骨形成，而人为的高表达PTGFR能促进软骨形成，PGF2α信号除受到自身水平的调控外也受到PTGFR的调控，持续的PTGFR表达才能刺激软骨分化。他们证实持续的PTGFR信号是软骨分化所必需的，PTGFR在诱导软骨生成和分化中发挥重要调控作用。但Sugimoto等[33]报道PTGFR基因敲出小鼠表型中没有任何显著的骨骼异常，这提示体内存在控制软骨形成的大量的前列腺素受体信号，PTGFR和PGE2受体(EP1)等前列腺素受体都偶联于Gq蛋白并通过增加钙和三磷酸肌醇发挥作用[34]。因此，其它前列腺素受体可能通过表达增加或敏感性增加以弥补PTGFR的缺乏。大量文献报道显示前列腺素调控BMPs表达，如Kim和Shim [32]发现BMP信号通路调节骨细胞增殖、分化的活性与PTGFR信号相关，他们发现BMP6的表达因PTGFR信号刺激而上调，而抑制内源性PTGFR会抑制BMP6的表达，提示PTGFR可能参与Bmp-6基因的调控。因为PTGFR信号参与调控软骨细胞生成和分化，所以PTGFR可能通过调控BMP信号通路调控软骨细胞的生成和分化。
综上所述，DDH的临床表现、诊断标准和治疗方案均较明确，遗传因素在DDH发病中发挥着重要作用这一观念也被大多数临床工作者和科研工作者所认同，目前发现至少5个基因的突变和DDH的发病相关。但DDH的发病机制仍不明确。本研究在一个DDH家系中发现与BMP信号通路相关并参与骨关节发育的BMP2K基因和PTGFR基因新突变并证实这2个基因的突变可能和该家系的DDH发病密切相关，但还需在大量的DDH散发病例和DDH家系中验证BMP2K基因和PTGFR基因的突变在DDH人群中的总体流行情况，同时也需要进一步的体内和体外实验以明确BMP2K和PTGFR突变是否的确导致了DDH的发病及其致病机制，并阐明基因型-表型间的关联。同时，本研究还提示BMP家族可能是参与DDH发病的重要信号分子之一，BMP信号通路可能是研究DDH发病机制的突破口之一。
无
