改建C57BL/6新生小鼠坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)模型，为深入探讨NEC的发病机制提供实验基础。
2日龄C57BL/6新生小鼠随机分为NEC模型组(36只)和对照组(11只)，NEC模型组给予100%氮气90 s＋4 ℃ 10 min＋脂多糖7 mg/kg干预建模，对照组仅予以同等体积生理盐水。比较两组间生长发育、肠道大体及病理差异，荧光定量PCR检测相关基因mRNA变化，免疫组化方法评估肠道细胞迁移和自我更新，免疫荧光检测细胞凋亡和增殖。Nadler标准病理评分≥3分定义为NEC样肠道损伤。
NEC模型组24 h之内死亡1只，48 h存活率为81%，72 h存活率为69%。对照组存活率为100%。NEC模型组和对照组实验前体重差异无统计学意义。实验24 h、48 h和72 h，模型组平均体重均显著低于对照组，P<0.05。模型组新生小鼠活动减少甚者完全静止，对刺激反应欠佳或无反应；而对照组生长发育良好[临床评分：对照组中位数＝0(0～1)，NEC模型组中位数＝7(3～12)，P< 0.01]。NEC模型组肠道标本表现为全肠段或部分肠段不同程度扩张和肠壁积气，严重者呈串珠样；以回盲部及其近端病变更为严重[肠道评分：对照组中位数＝0(0～1)；NEC模型组中位数＝4(1～6)，P<0.01]，镜下肠绒毛病变明显，Nadler标准病理评分≥3分20例，成模率为71%(20/28)。与对照组相比，NEC模型组细胞增殖减少(P<0.05)，细胞凋亡增加(P<0.05)，细胞迁移距离缩短(P<0.05)，炎症相关基因ICAM、CXCL-1、CXCL-2表达上调，肠道干细胞Lgr5表达下降。
本研究成功改建C57BL/6新生小鼠NEC模型，模型简洁高效、稳定可重复，能用于NEC的进一步研究。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是最为常见的新生儿外科急症，以肠道坏死为特征，401～1 500 g新生儿的平均发病率为11%，病死率高达15%～30% [1,2]。多个危险因素涉及NEC的发病，流行病学分析提示早产、肠道菌群紊乱、肠道缺血、人工喂养是公认的致病诱因[3,4,5]，但确切发病机制仍不清楚。NEC患儿手术切除的肠组织严重坏死且伴有非特异性炎症改变，并不适合研究疾病早期相关改变[5,6]。因此，体外动物模型的建立，可以更清楚了解该病的发生发展机制，对疾病的预防和治疗有重要价值。
很多动物模型应用于NEC的研究，如幼鼠急性肠道损伤模型、缺血再灌注模型等，然而这些模型并没有把新生儿和早产的特殊性考虑在内。针对这个局限性，由缺氧和肠系膜缺血诱导的新生猪NEC模型建立。随后新生大鼠模型出现，由缺氧冷刺激和人工喂养(FF＋HH)诱导。FF＋HH模型的病理改变明显，肠道损伤与人类NEC相似，但是FF＋HH模型应用于小鼠时，操作难度大，建模困难。动物模型是深入研究NEC的基础，因此本研究采用C57BL/6新生小鼠作为实验对象，依托我院实验平台进行建模探索。
本研究已通过复旦大学动物实验伦理审查。SPF级C57BL/6雄鼠和雌鼠均购于复旦大学上海医学院实验动物中心，交配受孕后自然分娩。实验对象为2日龄新生小鼠，每只孕鼠分娩后按照3∶1比例按数字表法随机分为NEC模型组和对照组。6只孕鼠一共产仔47只，NEC模型组36只，对照组11只。NEC模型组给予LPS、缺氧和冷刺激进行干预，对照组仅予同等生理盐水。所有新生小鼠均母鼠喂养。实验时间为72 h。① LPS注射：将1 mg LPS以0.25 mg/ml稀释于4 ml生理盐水中。2日龄新生小鼠称重，NEC模型组新生小鼠按照7 mg·kg－1·d－1经腹腔给予LPS，对照组给予相同体积的生理盐水，连续3 d；②缺氧冷刺激：将测氧仪置于密闭缺氧箱内，入气孔中充入100%氮气，控制氮气流量为10 L/min，当箱内氧气浓度降至0后迅速将模型组新生小鼠置入，持续通入氮气，维持100%氮气90 s后取出新生小鼠，立即将其置于4 ℃冰箱中10 min，每日3次，处理后置于37 ℃保温毯上，2 h后送回母鼠身边，连续3 d。
Ecoli 0111：B4脂多糖(lipopolysaccharide，LPS；Sigma)，5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU，sigma)，Ki67抗体(Abcam) ，BrdU抗体(Abcam)，荧光二抗(Abcam)，GTVisionMIII型免疫组化检测试剂盒(基因科技)，TUNEL凋亡检测试剂盒(罗氏)，RNAlater(QIAGEN)，RNA提取试剂盒(OMEGA)，转录及荧光定量PCR试剂盒(TAKALA)，1.9F经外周静脉置入中心静脉导管(PICC管，UTMD)，希玛AR8100氧气浓度含量检测仪，100%氮气由复旦大学附属儿科医院提供，4℃冰箱，0.01g精准电子称，根据实验需要自制缺氧箱。
利用BrdU评估肠上皮细胞迁移能力的变化，NEC模型组和对照组部分新生小鼠腹腔单次注射BrdU(30 μg/g)，40 h后取材待检。
实验开始前记录每只新生小鼠体重，在实验过程中定时称量每只新生小鼠体重，精确至0.01 g，同时记录死亡的数量和大致死亡的时间。
实验过程中的每个干预节点，对NEC模型组和对照组进行观察和疾病评分。目前缺乏小鼠的NEC评分细则，因此参考新生大鼠的疾病评分表并进行相应修改[7,8,9](表1)。
疾病临床评分标准
疾病临床评分标准
| 评分 | 外观 | 反应能力 | 活动情况 | 颜色改变 |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 活泼无脱水 | 无刺激下保持警惕状态 | 活动正常 | 灰色-黑色 |
| 1 | 体重减轻，活泼/无脱水 | 对轻微刺激有反应 | 倦怠/可活动 | 灰色 |
| 2 | 消瘦/倦怠/脱水，蜷缩/可见腹部膨隆 | 对剧烈刺激有反应 | 倦怠/不能活动 | 粉色-灰色 |
| 3 | 痉挛/抽搐，痛苦，腹部明显膨隆 | 对任何刺激反应欠佳 | 不活动四肢/静止状态 | 粉色 |
在实验过程中，模型组若是出现严重的腹部膨隆，呼吸暂停，倦怠，明显抽搐等情况时立即断颈处死留取标本，其余72 h后断头取材[10]。自腹正中线打开腹腔，仔细分离肠系膜及血管，认真观察肠道进行评分(表2)。然后用1.9F PICC管经肛门用4℃ PBS缓慢灌肠，将肠道标本分为3份，1份存于4%多聚甲醛溶液中，1份存于RNAlater中，1份置于冻存管中存于－80 ℃。
肠道标本评分标准
肠道标本评分标准
| 评分 | 肠道的连续性 | 肠道颜色 | 肠道扩张 |
|---|---|---|---|
| 0 | 正常 | 正常 | 正常 |
| 1 | 轻度易碎 | 部分变色 | 部分扩张 |
| 2 | 严重易碎 | 广泛变色 | 广泛扩张 |
将存留于4%多聚甲醛的肠道标本脱水后石蜡包埋，作5 μm连续切片，常规HE染色，肠道组织病理评分参考Nadler标准进行双盲法评分，0分：肠道绒毛及上皮完整，组织结构正常；1分：轻微黏膜下或固有层肿胀分离；2分：中度黏膜下和/或固有层分离，黏膜下和/或肌层水肿；3分：重度黏膜下和/或固有层分离，黏膜下和/或肌层水肿，局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失伴肠坏死。病理评分≥3分者视为NEC样肠道损伤[11]。
通过免疫荧光观察肠道Ki67阳性细胞，比较NEC模型组和对照组肠道隐窝细胞增殖情况。石蜡切片烤片脱蜡后热修复，清除过氧化物酶，5%BSA封闭后滴加1∶100一抗，4 ℃过夜后孵育荧光二抗，DAPI染色，封片及荧光显微镜下观察计数。
通过免疫组化观察BrdU阳性细胞分布，比较NEC模型组和对照组肠道隐窝细胞增殖情况，只计数最外层阳性细胞。计算肠上皮隐窝处至绒毛最远端染色细胞之间距离(微米)；迁移距离与绒毛全长的比值；肠上皮隐窝处至绒毛最远端染色细胞之间BrdU阳性细胞数。石蜡切片脱蜡后热修复，清除过氧化物酶，3%BSA封闭后滴加1∶10一抗，4 ℃过夜后孵育二抗，DAB染色，封片及显微镜下观察计数。
通过免疫荧光检测肠道细胞凋亡变化，比较两组是否存在差异。石蜡切片脱蜡后参考罗氏TUNEL细胞凋亡检测操作手册进行。
采用荧光定量PCR法测定新生小鼠肠道细胞中ICAM、CXCL-1、CXCL-2炎症相关mRNA和肠道干细胞标记物Lgr5表达变化(表3)。小鼠肠道组织总RNA的提取根据OMEGA E．Z.N.A.Total RNA Kit说明书进行，微量分光光度计检测RNA纯度和浓度。cDNA合成参考PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser说明书进行。荧光定量PCR以β-actin作为内参对照，单个样品均作3孔重复以减少实验误差。
荧光定量PCR引物
荧光定量PCR引物
| 引物 | 5’-3’ | 3’-5’ |
|---|---|---|
| ICAM | AACCTCCACATCCCCTGTTTT | GCCCTGGCATGGATAACCA |
| CXCL-1 | AGAACATCCAGAGCTTGAAGG | CAATTTTCTGAACCAAGGGAGC |
| CXCL-2 | GAAGTCATAGCCACTCTCAAGG | CTTCCGTTGAGGGACAGC |
| Lgr5 | CACCCCAATGCGTTTTCTAC | GATGGTATCAGGCTCTGTAAGG |
SPSS20.0统计学软件进行统计学分析，组间采用独立T检验分析，P<0.05判定为差异有统计学意义。
NEC模型组36只新生小鼠，对照组11只新生小鼠。NEC模型组24 h之内死亡1只，48 h存活率为81%，72 h存活率为69%。对照组存活率为100%(图1A)。24 h内死亡的新生鼠，不能归因于NEC，因为24 h内不产生NEC样肠道病理改变。可能是因为围产期并发症造成，如呼吸窘迫综合征，窒息，呼吸道感染等[6]。所以24 h内发生的死亡在生存分析中用作截尾数据，不纳入最终的NEC成模率计算。
NEC模型组新生小鼠均在造模过程中出现不同程度生长发育缓慢，较对照组明显滞后，体重增长缓慢甚至降低，皮下脂肪减少，皮肤松弛，皮肤颜色改变缓慢(图2A)。NEC模型组和对照组实验前平均体重为：(1.82±0.18) g和(1.74±0.17) g(P>0.05)，实验24 h、48 h、72 h体重差异均有统计学意义(图1B)。
NEC模型组新生小鼠出现倦怠、痉挛、抽搐、腹膨隆、蜷曲而卧，可见绿色或黑红色稀便，活动减少甚至完全静止，以实验第二天及第三天表现更为明显。随着时间的延长，NEC模型组对刺激反应欠佳甚者无反应。对照组生长发育良好，皮下脂肪丰满，体重增长快，活动正常，对刺激反应好，大便无异常[疾病临床评分：对照组中位数＝0(0～1)，NEC模型组中位数＝7(3～12)，P< 0.01，图1C]。
NEC模型组肠组织较之对照组均有改变[肠道评分：对照组中位数＝0(0～1); NEC模型组中位数＝4(1～6)，P<0.01]。肠管呈黑红色、黄红色和绿色，以回盲部以上近端病变更为严重。肠道易碎弹性差，出现全肠段或部分肠段不同程度肠道扩张和肠壁积气，严重者呈串珠样。对照组肠管呈黄色，弹性佳，偶可见部分肠道轻度扩张(图2B, 图2C, 图2D)。
NEC模型组肠绒毛病变明显，排列紊乱，部分甚至全部绒毛坏死，脱落消失，肌层变薄甚至断裂，肠道出血(图2F, 图2G, 图2H)。双盲法病理学评分≥3分定义为NEC样肠道损伤，NEC的成模率为71%(图1D)。(注：7只实验小鼠因死亡自溶未取标本，1只被食，有效标本为28份)。对照组肠道结构正常，绒毛，黏膜层、黏膜下层、固有层完整(图1E)。两组肠道损伤病理评分差异有统计学意义(P<0.05)。
Ki67阳性细胞主要位于隐窝基地部，NEC模型组Ki67阳性细胞明显减少(图3，P<0.05)。
NEC模型组BrdU阳性细胞最高位明显低于对照组。肠上皮隐窝处至绒毛最远端染色细胞之间的距离对照组＝136.45 μm，NEC模型组＝70.5 μm；迁移距离与绒毛全长的比值对照组＝1.0，NEC模型组＝0.3；肠上皮隐窝处至绒毛最远端染色细胞之间BrdU阳性细胞中位数对照组＝10(7～13)，模型组＝4(1～12)，P<0.05(图4)。
对照组凋亡细胞计数极少，NEC模型组可在绒毛轴和隐窝处检测到阳性凋亡细胞[对照组中位数＝0(0～1); NEC模型组中位数＝12(1～25)，P<0.05，图5]。
肠组织中ICAM、CXCL-1、CXCL-2、Lgr5基因的转录水平见图6。
医学研究的进展常常依赖于使用动物模型作为实验假说和临床假说的实验基础。NEC发病原因复杂，动物模型的建立，为深入探讨其发病机制及疗效机制提供了可能。一个简单高效的动物模型，有助于更方便、更有效地认识NEC的发生、发展规律和研究防治措施。
NEC模型相关的动物涉及猪、兔和鼠等。猪的消化道和婴儿相比结构和功能高度相似，体型大小也相似。缺点是花费高，维持早产猪的存活和喂养很困难，对硬件设施要求极高，遗传背景多变。兔子也因遗传背景多变，使用价值有限。大鼠价格便宜、易饲养，妊娠期短，产仔量高，容易诱导NEC的产生，该模型较成熟且运用较多。虽然大鼠有很多优势，但在遗传学研究方面小鼠是更优选择，因其可以基本上真实模拟人类疾病的发病过程及对药物的反应。1981年小鼠胚胎干细胞体外培养技术成功建立[12]，推进了基因工程技术的运用，能在体外试验中对小鼠基因组进行精准的遗传修饰，为人类疾病小鼠模型提供可行路线[13]。然而，等效的大鼠胚胎干细胞目前还不可用，同时小鼠胚胎干细胞技术的发展促进了转基因小鼠的出现，有助于生物医学研究[14]。这些技术优势目前只在小鼠模型系统中得以充分体现。因此，利用大鼠构建和探索以遗传为基础的动物模型，可行性明显落后于小鼠。此外，人类和大鼠对于细菌和内毒素的忍受能力有着显著的差异(大鼠忍受能力更强)；大鼠与人类NEC相关性不明确等限制了对肠道损伤的细胞信号转导通路研究[15,16]。
采用C57BL/6小鼠建模，有助于确定参与疾病发病的分子机制以及相关上皮细胞损伤机制。肠道菌群紊乱是NEC重要的发病诱因，Guo等[17]证实LPS诱导肠道通透性增加及肠道炎症，由FAK-MyD88-IRAK4信号通路调控，血清素和催产素对肠道炎症程度也有影响[18]。TLR4是介导LPS应答的主要受体，Egan等[19]研究认为TLR4上调CCR9 / CCL25信号通路使淋巴细胞聚集，同时TLR4通过STAT3增加CD3＋、CD4＋、IL-17 ＋和减少Treg。Zhou等[20]利用TLR4敲除小鼠探索TLR4介导的炎症反应和坏死在NEC发生发展中的作用。细菌或细菌抗原侵犯机体时，潘氏细胞分泌多种抗微生物成分，如α防御素、溶菌酶等，是肠黏膜屏障的重要效应分子。Podany等[21]利用ZnT2基因缺失小鼠，研究ZnT2介导的锌转运对潘氏细胞分泌功的重要意义，White等[22]发现了一种未知的潘氏细胞耗损引发肠道损伤发展机制并且不依赖于TLR4通路。肠道血液供应不足可以导致不同程度的肠壁局部组织坏死而引发肠穿孔，Yan等[23]认为VEGFR2信号缺失导致肠微血管发育不良从而诱发NEC。Torikai等[24]发现肠内硝酸咪康唑通过抑制IL-8和HMGB-1预防极低体重新生儿肠穿孔。此外，Jilling等[25]也证实特定基因在NEC发病率中的作用，Bergmann等[26]、Mustafi等[27]还利用该小鼠模型为临床评估提供了有用信息。
不存在任何一种单一的动物模型能够准确模拟人类疾病表型。国内外现在关于NEC模型方法不一，但主流是应用FF＋HH建模，其他还有缺血再灌注，血小板活化因子(PAF)注射，潘氏细胞损耗，感染和化学损伤等都被应用了NEC模型研究。应用FF＋HH建立NEC小鼠模型，根据新生小鼠日龄，配方奶是否含有细菌或者LPS，缺氧冷刺激方式的不同存在变化。FF＋HH建模最初采用剖腹产的新生小鼠，但剖宫产病死率高。研究显示妊娠17 d的胎鼠，相当于24周人类胎儿，2日龄新生鼠与人类小于33孕周胎儿相似，5日龄新生鼠被认为是足月儿胎龄大小，即相当于40周[28]。即生后到生后5日龄之间的肠道损伤，相当于早产儿损伤。自然分娩能减少剖宫产手术差异带来的潜在混杂影响[6] ，并且重症NEC与分娩方式无明显的关联[29]。利用自然分娩的新生小鼠作为实验对象，有助于基因敲除和转基因品系进一步探索NEC。
本实验尝试多种方法造模：A.1日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；B.2日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；C.3日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；D.4日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；E.5日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；F.5日龄新生小鼠＋(人工喂养＋LPS 5 mg/kg/day)＋(5%氧气10 min＋4 ℃ 10 min，2次/d)；G.5日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 4 mg·kg－1·d－1；H.5日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋ 4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 3 mg·kg－1·d－1；I.5日龄新生小鼠＋人工喂养＋(5%氧气10 min＋ 4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 2 mg·kg－1·d－1；J.1日龄新生小鼠＋(100%氮气90 S＋ 4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；K.1日龄新生小鼠＋(100%氮气60 S＋4 ℃ 10 min，3次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；L.2日龄新生小鼠＋(100%氮气120 S＋4 ℃ 10 min，3次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；M.2日龄新生小鼠＋(100%氮气60 S＋4 ℃ 10 min，3次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1；N.2日龄新生小鼠＋(100%氮气60 S＋4 ℃ 10 min，3次/d)＋LPS 7 mg·kg－1·d－1；O.2日龄新生小鼠＋(100%氮气90 S＋4 ℃ 10 min，2次/d)＋LPS 5 mg·kg－1·d－1。A-E造模结果可见：虽然随着小鼠日龄的增加，生存率稍有改善，但是人工喂养新生小鼠整体病死率高；F-I说明：LPS减量并不能改善新生小鼠的病死率，考虑是因为人工喂养的原因。早产是NEC非常重要的诱因，5日龄内新生小鼠体型太小器官组织太脆弱，操作困难，人工喂养病死率极高。侵入性操作易导致口腔出血，误入气管和食道穿孔，引起的死亡和损伤可能远超过奶液本身对模型的影响。相较之，2日龄新生小鼠＋100%氮气90 s＋4 ℃ 10 min＋LPS 7 mg/kg，病死率较低且成模率稳定。
高效建立动物模型是疾病研究的基础，同时需要平衡成模率和成活率。应用2日龄C57BL/6新生鼠＋100%氮气90 s＋4 ℃ 10 min＋LPS 7 mg/kg建模具有明显优势：①采用小鼠建模有助于确定参与疾病发病的分子机制以及相关上皮细胞损伤机制；②基于能够引起和导致该疾病的因素，尤其考虑婴儿时期发育特点；③包括早产，缺氧，微生物失调等重要诱因；④肠道损伤明显；⑤回肠病变更为严重；⑥评分标准更为严格；⑦新生小鼠存活率相对高；⑧新生小鼠成模率稳定可重复；⑨模型高效：建模方案未采用人工喂养，因为人工喂养新生小鼠大多通过1.9 F PICC管经食道插入胃中，每3 h需要喂养一次，实验工作量大，需要团队合作，实验数量受限并且很难短时间内重复实验；⑩利于实验室间模型复制和数据统计：排除了奶粉种类、每次喂养的量、是否混合LPS或细菌，高渗还是等渗奶等影响；⑪有利于在遗传学研究方面：研究显示任何经口途径的干预可能会干扰对NEC相关遗传危险因素的研究[30]；⑫符合临床特点：低体重新生小鼠病死率相对高，肠道损伤更为严重。
NEC发病机制目前尚不明确，动物模型是极为重要的研究方法和手段。相较于猪、大鼠等实验动物，小鼠具有基因改造技术成熟、能构建转基因动物模型、进行基因敲除、保证遗传背景上的高度稳定性等优势。应用2日龄C57BL/6新生鼠＋100%氮气90 s＋4 ℃ 10 min＋LPS 7 mg/kg建模，成功简化NEC动物模型。该模型制备简单可重复，成模率稳定，为今后NEC疾病的基因研究提供实验基础。
无
