探讨钙视网膜蛋白(calretinin，CR)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)在新生儿先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease, HSCR)直肠黏膜活检病理诊断中的应用价值。
收集2015年1月至2016年1月新生儿直肠黏膜活检标本62例。此62例患儿均有出生后反复出现腹胀、便秘、胎便延迟和/或呕吐等症状，临床诊断或疑诊HSCR。其中，男47例，女15例；年龄为3～28 d，平均17 d。在显微镜下观察黏膜下神经节细胞和神经纤维直径，免疫组织化学标记CR和酶组织化学染色AchE。根据直肠黏膜活检标本黏膜下HE染色有、无神经节细胞将患儿分为非HSCR组和HSCR组，比较两组CR和AchE的表达。
HSCR组(49例)无髓鞘神经纤维直径在30～70 μm，平均49.6 μm；其中直径≥40 μm 42例(85.7%)，<40 μm 7例(14.3%，30～38 μm)。CR无阳性表达患儿。AchE阳性45例(91.8%)，阴性4例(8.2%)。非HSCR组(13例)无髓鞘神经纤维直径<25 μm者12例(92.3%)；神经纤维直径35 μm者1例(7.7%)。CR阳性13例(100%)；AchE阳性1例(7.7%)，阴性12例(92.3%)。CR表达在HSCR诊断中的敏感性和特异性为100%(12/12)，98.0%(49/50)；阳性预测值为92.3%(12/13)，阴性预测值为100%(49/49)。AchE在HSCR诊断中的敏感性和特异性分别为93.9%(46/49)和100%(12/12)，阳性预测值100%为(46/46)，阴性预测值为75.0%(12/16)。
直肠黏膜活检HE染色结合CR和AchE的病理诊断，有助于提高新生儿HSCR病理诊断准确率，具有较好的应用价值。
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先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease，HSCR)是儿童常见的消化系统先天性畸形，发病率为1/5 000，临床主要表现为新生儿排便延迟或婴幼儿及儿童严重便秘等[1]。由于新生儿常常临床症状不典型，钡灌肠形态学改变不明显，常导致临床诊断延迟或漏诊[2]。直肠黏膜活检目前仍是HSCR术前病理诊断的可靠方法。但新生儿常伴有结肠炎及肠神经元发育未成熟，或活检组织标本取材太小，给常规病理诊断带来挑战。这时免疫组织化学检测钙视网膜蛋白(calretinin，CR)及酶组织化学检测乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)对HSCR的辅助诊断有一定价值[3,4]。现将我院近期对新生儿直肠黏膜活检病理诊断的体会进行总结报道。
收集我科2015年1月至2016年1月临床疑诊或待除外HSCR且资料完整的直肠黏膜活检标本62例和手术切除标本49例。其中，临床资料来源于病历记录，资料提供来源于患儿监护人。随访方式为患儿复诊和电话随访，时间终止于2016年9月，随访时间2个月至1年9个月。所有患儿家属均签署知情同意书。
62例中，男47例，女15例；年龄为3～28 d，平均17 d；临床表现均有出生后反复出现腹胀、便秘、胎便延迟和/或呕吐；术前均行钡剂灌肠检查，提示24 h后结肠钡剂残留，结肠动力活动性差(图1)。直肠测压检查提示直肠肛门抑制反射差。
直肠黏膜活检部位取自齿状线上1.5～3.0 cm，每例取1～3块，行15 μm冰冻切片2～6张，留做AchE染色；剩余组织用4%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，每个蜡块连续切60～80张(2例连续切片100张)，HE染色；另留取2～5块切片行免疫组织化学染色；黏膜下组织至少占标本1/3方为合格标本。所有标本由两位高年资病理医师在显微镜下观察神经节细胞并测量每例神经纤维丛的最大直径。
对直肠黏膜活检标本和HSCR术后根治标本的狭窄端和扩张端进行免疫组织化学标记CR，抗体购置于福州迈新生物技术开发有限公司，采用En-Vision法，实验操作按照说明书进行，DAB显色，同时设阴性及阳性对照。免疫组织化学判断标准：阳性表达定位于黏膜固有层、黏膜肌层、黏膜下神经纤维和神经节细胞，CR阳性在固有层和黏膜肌层呈棕黄色细丝状，黏膜下神经纤维呈棕黄色粗纤维丝状，神经节细胞呈棕黄色颗粒团块状；阴性表达为无棕黄色纤维丝，肥大细胞呈棕黄色可作为内对照[3]。
直肠黏膜活检标本均进行AchE检查，AchE阳性的神经纤维呈棕褐色，连续或网状分布在黏膜固有层腺体间、黏膜肌层和黏膜下层；阴性表达在黏膜固有层腺体间、黏膜肌层和黏膜下层无或仅有少量断续的神经纤维丝[4,5]。
直肠黏膜活检和手术标本根治标本的病理诊断参照参考文献[1]标准。
直肠黏膜活检中钙视网膜蛋白和乙酰胆碱酯酶的表达(例)
直肠黏膜活检中钙视网膜蛋白和乙酰胆碱酯酶的表达(例)
| 组别 | 例数 | 神经节细胞 | 神经纤维直径 | 钙视网膜蛋白 | 乙酰胆碱酯酶 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 有 | 无 | ≥40 μm | <40 μm | 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | ||
| HSCR组 | 49 | － | 49 | 42 | 7 | － | 49 | 45 | 4 |
| 非HSCR组* | 13 | 13 | － | － | 13 | 13* | － | 1* | 12 |
注：*其中1例修正诊断为短段型巨结肠，因此设钙视网膜蛋白假阳性，乙酸胆碱酯酶真阳性。
根据直肠黏膜HE染色观察有无神经节细胞将患儿分为非HSCR组(13例)和HSCR组(49例)。
HSCR组49例直肠黏膜活检标本黏膜下HE染色无神经节细胞，无髓鞘神经纤维直径在30～70 μm(图2)，平均49.57 μm，中位直径48 μm，其中直径≥40 μm者42例(85.7%)；直径<40 μm者7例(14.3%，30～38 μm)。CR阴性表达49例(100%)，无阳性表达病例。AChE阳性45例(91.8%，图3)，阴性4例(8.2%)。手术标本：CR在狭窄段阴性表达，扩张段呈阳性表达，阳性信号同时位于黏膜固有层、黏膜肌层、黏膜下层及肌间(图4)。
非HSCR组13例黏膜下组织中可见神经节细胞，无髓鞘神经纤维直径<25 μm者12例(92.3%，图5)；1例神经纤维直径35 μm，结合CR和AchE结果，将诊断修改为HSCR；2例经连续切片100张，才找到神经节细胞，不伴有神经纤维增粗。CR阳性表达13例(100%)，阴性表达无，阳性表达信号位于黏膜固有层1例，黏膜肌层1例，黏膜肌和黏膜下层6例，黏膜固有层、黏膜肌层和黏膜下层同时表达5例(图6)。AchE阴性12例(92.3%)，阳性1例(7.7%)。
49例经直肠黏膜病理诊断为HSCR的患儿，45例行通便、扩肛后临床症状有所减轻，2～3个月后行根治手术；4例经上述处理临床症状仍然难以缓解，同期行造瘘，2～4个月后再行根治手术。术后标本均经病理检查证实为HSCR，其中1例为全结肠型巨结肠。
13例非HSCR，12例未行手术治疗，经扩肛、通便、清洁灌肠等保守治疗后，病情缓解；1例修改为HSCR的患儿，术后标本证实为短段型巨结肠。
62例中，CR表达的敏感性为100%(12/12)，特异性为98.0%(49/50)，阳性预测值为92.3%(12/13)，阴性预测值为100%(49/49)。AchE表达的敏感性为93.9(46/49)，特异性为100%(12/12)，阳性预测值为100%(46/46)，阴性预测值为75.0%(12/16)。
HSCR是一种肠壁神经节细胞发育异常性疾病，临床主要表现为新生儿排便延迟或婴幼儿及儿童严重便秘等，病理形态学改变以结肠远端黏膜下和肌间神经丛中神经节细胞完全缺如和肠壁远段黏膜下及肌间胆碱能神经纤维增生，形成所谓"粗大神经丛"为特征。由于这些特征性改变，使得直肠黏膜活检病理诊断逐渐被临床应用于术前HSCR的诊断[8]。但新生儿临床症状不典型，肠壁薄，常导致临床取材困难，并常伴有结肠炎和神经元细胞发育不良，使得病理形态学诊断困难而造成误诊或漏诊[9]。因此，结合免疫组织化学以及酶组织化学染色有助于提高诊断。
HSCR直肠黏膜活检黏膜下通常缺乏神经节细胞，同时伴有粗大的神经纤维是HSCR较直观的病理诊断方法[7]。在连续切片中，总能找到直径≥40 μm的粗大神经纤维丛，质地较致密，此时病理诊断HSCR较可靠。尽管文献报道HSCR粗大的神经纤维直径≥40 μm[1]，但也有神经纤维直径在30～40 μm。非HSCR新生儿直肠黏膜下可见神经节细胞，神经纤维丛直径常≤25 μm，质地较疏松；如出现较粗大的神经纤维，这时不除外短段型或移行段巨结肠，临床可保守治疗和随访观察，如临床症状无缓解，可再次活检。如直肠黏膜下无神经节细胞，神经纤维也没有增粗，要警惕组织取材部位是否位于肛门直肠无神经节细胞区域，通常在齿状线上1 cm[9]。如观察到鳞状上皮和肠上皮的移行过渡区，则更能证明取材部位欠佳，此时最好重新取材。
依靠HE染色病理诊断HSCR需有经验丰富的病理医师和高超的病理制片技术。本组有2例连续切片100张才明确诊断，对病理技术是一个挑战。同时，还必须保证标本取材足够大小和深度符合要求。对于不成熟的神经节细胞和合并结肠炎的淋巴单核细胞用常规HE染色非常难鉴别，易导致误诊。这时如能结合免疫组织化学和酶组织化学染色，对病理诊断会有较大帮助。
CR是一种重要的钙结合蛋白，其相对分子量为29×103，含269～271个氨基酸，由16q22-q23基因编码组成，主要集中表达于中枢神经和外周神经系统[10]。CR在正常结肠黏膜下和肌间神经节细胞和神经丛中表达，在HSCR中有神经节细胞的扩张段结肠表达，在无神经节细胞的狭窄段结肠不表达。文献报道由于其染色显色清晰，可同时表达于结肠黏膜下组织和黏膜固有层，从而弥补了临床取材较表浅而无法行常规HE观察的缺陷，也可减少HE染色连续切片的数量[11]。本组HSCR直肠黏膜CR表达阴性，非HSCR表达阳性，提示其具有良好的参考价值。有研究表明，在新生儿HSCR中CR的敏感性和特异性分别为100%和97.44%，在非HSCR中其敏感性和特异性则分别为84.62%和100%[6]。另一研究中，CR阳性预测值为100%，阴性预测值为93.3%[12]。本组CR在HSCR表达的敏感性和特异性为100%和98%，阳性预测值为92.3%，阴性预测值为100%，与文献报道类似。但我们注意到新生儿直肠黏膜活检和HSCR手术标本扩张段肠组织的表达模式有所不同。前者只有7例黏膜固有层表达，且很少呈连续性，更多在黏膜肌、黏膜下神经节细胞和神经纤维丝中表达；而后者在固有层、黏膜肌层和黏膜下层均同时表达，并呈连续性，因此要求标本取材不能过浅，观察重点应在黏膜肌和黏膜下层组织中，而不都是在固有层。
由于HSCR神经节细胞的缺失，副交感神经节前纤维不能与神经节细胞形成触突，导致副交感神经进入肠壁，乙酰胆碱递质囊泡和去甲肾上腺素递质囊泡增加，成为HSCR AchE检查的理论基础[13,14]。有研究提出AchE染色的特异性较高，准确率为95.59%，阳性预测值100%，一般没有假阳性病例[15]。本组AchE染色在新生儿HSCR的病理诊断中的敏感性和特异性分别为93.9%和100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为75%。假阴性出现在新生儿，原因可能与酶系统发育不成熟有关。其次，冰冻切片操作延迟、超短段型等因素也会影响AchE的活性[16]。本组有1例疑HSCR，HE染色在黏膜下可见神经节细胞，神经纤维直径在35 μm，CR在黏膜下呈现弱阳性，AchE表达阳性，提示移行段肠组织，经手术后证实为短段型巨结肠。由此可见，在直肠黏膜活检常规HE染色呈可疑病理形态时，同时辅助CR和AchE染色(图7)，可从组织病理、免疫病理及酶组织化学不同角度综合分析，也为目前病理诊断推荐模式，使得HSCR术前诊断更准确，从而有效减少误诊率[1]。
注：NF为神经纤维直径；CR为钙视网膜蛋白；AchE为乙酰胆碱酯酶；HSCR为先天性巨结肠症
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