探讨丁酸对SD大鼠肠黏膜屏障的作用情况，为防治坏死性小肠结肠炎等肠道疾病提供实验依据。
以生后7 d(P7)的SD新生鼠为实验对象，采用随机数字表法，选取实验组(12只)、生理盐水对照组(8只)和空白对照组(8只)大鼠。实验组给予丁酸，生理盐水对照组给予生理盐水，连续灌胃早晚各1次；空白对照组不做任何处理。10 d后取幼鼠近端结肠组织，利用尤氏灌注系统(Ussing Chamber)检测肠黏膜跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance，TER)值；Western Blot检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及Claudin-1的表达情况；免疫组织化学法检测近端结肠组织ZO-1和Occludin的表达及分布情况(OD值)。
尤氏灌注系统发现丁酸组在0、30、60、90、120 min的TER值分别为(70.65±5.03)Ω·cm2、(72.40±5.58)Ω·cm2、(68.84±5.02)Ω·cm2、(64.64±4.64)Ω·cm2和(58.95±6.23)Ω·cm2，生理盐水对照组分别为(63.56±4.28)Ω·cm2、(59.31±4.07)Ω·cm2、(51.73±4.42)Ω·cm2、(45.28±5.18)Ω·cm2和(42.09±4.06)Ω·cm2，空白对照组分别为(59.99±4.21)Ω·cm2、(56.64±3.71)Ω·cm2、(51.53±4.00)Ω·cm2、(48.01±7.40)Ω·cm2和(45.41±10.00)Ω·cm2。丁酸组各时间点TER值与生理盐水对照组及空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.001)；生理盐水对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。丁酸组紧密连接(TJ)蛋白Occludin及Claudin-1的表达(1.03±0.05、2.02±0.21)较生理盐水对照组(0.74±0.08、1.06±0.09)及空白对照组(0.73±0.05、1.04±0.06)增加，且组间比较，差异均有统计学意义(P<0.001)；而生理盐水对照组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。组织学免疫组织化学检测发现丁酸组肠上皮细胞间ZO-1及Occludin的表达(0.22±0.04、0.26±0.04)较生理盐水对照组(0.16±0.02、0.21±0.02)及空白对照组明显增加(0.16±0.01、0.21±0.02)，且组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而生理盐水对照组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。
在哺乳期肠黏膜屏障模型中，丁酸增加紧密连接蛋白的表达，能较快促进肠黏膜组织结构与功能发育成熟。
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有研究表明，丁酸在预防肠易激综合征、腹泻、炎症性肠病等方面都发挥了重要作用[1,2,3,4]。此外，丁酸还在抑制癌细胞的增殖及协同其他药物治疗结肠癌方面表现出抗癌作用，也是肠道正常菌群调节肠黏膜屏障和黏膜免疫系统的重要中介因子[5,6,7,8]。断奶前即哺乳期是肠黏膜屏障(Intestinal Mucosal Barrier)尚未成熟的特殊时期，缺乏对各种应激的抵抗力[9]。本实验从发育学角度探讨丁酸对SD大鼠肠黏膜上皮功能的影响，为防治新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)、新生儿营养调控、减少抗生素使用等提供实验依据。
丁酸(Sigma，美国)，磷酸盐缓冲液(PBS)(Solarbio，中国)，ZO-1，Claudin-1多克隆抗体(Invitrogen，美国)，Occludin多克隆抗体(Proteintech，中国)，GAPDH单克隆抗体(Bioworld，美国)，山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(Bioworld，美国)，DAB检测试剂盒(中杉金桥，中国)用于免疫组织化学。10×Krebs-Ringer溶液(73.6 g/L氯化钠、1.87 g/L氯化钾、1.66 g/L磷酸二氢钠合水、2.44 g/L氯化镁、3.68 g/L氯化钙)，Manital-Krebs溶液(10×Krebs-Ringer、1.98 g/L碳酸氢钠、1.82 g/L甘露醇)，Glucose-Krebs溶液(10×Krebs-Ringer、1.98 g/L碳酸氢钠、1.8 g/L葡萄糖)，以上溶液配方材料来源于Sigma，美国。
所有的实验程序都遵守动物福利的道德原则，所有实验鼠由温州医科大学动物中心提供(补动物中心的生产批准文号或动物的生产批号)。取出生后7 d的SD大鼠，按随机数表法随机分入丁酸组(12只，实验中有3只死亡)、生理盐水对照组(8只)和空白对照组(8只)。丁酸组按0.2 ml/10 g体重给予大鼠160 mmol/L丁酸溶液灌胃，1天2次；生理盐水对照组每天生理盐水进行2次灌胃；空白对照组不做任何处理。三组小鼠均正常母乳喂养。10 d后麻醉(1%戊巴比妥钠，5 μl/g)并处死三组大鼠，收集近端结肠组织和结肠内容物。
取近回盲部结肠组织，约2 cm。将每个标本沿肠系膜缘打开，然后用预冷的生理盐水冲洗并保存于预充有(95%O2-5%CO2)气体的生理盐水中，然后固定在尤氏室上。准备标本安装在6通道Ussing chmber系统(Physiologic Instruments，USA)，孔面积0.031 cm2。然后，将5 ml Manital-Krebs缓冲液加入到黏膜侧，同时加入5 ml的Glucose-Krebs缓冲液加入浆膜侧。通过使用循环水将尤氏系统保持在37℃的恒定温度。系统稳定10 min后，连续记录每个样品的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance，TER)值120 min。
取各组大鼠的回盲部组织置于匀浆管，向匀浆管中加入预冷的蛋白裂解液(RIPA∶PMSF＝100∶1)，机械裂解后在冰上静置30 min。匀浆液4℃，850 g，离心5 min后超声裂解。再4℃，13 500 g，离心5 min后，取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。具体过程如下：上样量40 μg，SDS-PAGE凝胶电泳。转膜后放于封闭液(含5%脱脂奶粉)室温封闭2 h。TBST清洗3次，每次10 min后，加入一抗[多克隆兔抗Occludin、Claudin-1(1∶1 000)，单克隆兔抗ZO-1(1∶500)，单克隆鼠抗GAPDH(1∶5 000)]。4℃孵育过夜后，TBST连续洗膜3次，每次10 min。用5%脱脂奶粉－TBST[山羊抗兔/鼠IgG(H＋L)，1∶5 000]室温轻摇孵育2 h。TBST清洗3次，每次10 min后，ECL法显色曝光。ChemiDoc MP系统(Bio-Rad，USA)采集图像，Image lab软件进行灰度值分析。
紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达情况，以各目的蛋白条带的灰度值与对应的内参照(GAPDH)的灰度值比值视为目标蛋白的表达水平。
新鲜回盲部标本4%甲醛固定，石蜡包埋，垂直肠管长轴切成4 μm厚的连续切片。将上述组织石蜡切片常规烘烤、二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水待用。将切片浸泡于0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中，在压力锅内加热至沸腾(10 min)修复抗原，室温冷却20 min。3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭非特异性抗原(30 min)，拭去血清。PBS清洗3次，每次5 min后加一抗(多克隆兔抗ZO-1，Occludin 1∶200)，4℃冰箱下孵育过夜。第2天室温下复温20 min，加二抗(生物素标记的山羊抗兔IgG)室温孵育20 min。DAB液显色，显微镜下观察染色情况适时终止。苏木素复染，用0.1% HCl分化，自来水冲洗蓝。最后切片经脱水、透明后中性树胶封固，显微镜下观察。
ZO-1和Occludin蛋白表达判断方式：在光学显微镜放大200倍下，棕黄色颗粒为阳性蛋白表达。应用图像分析软件Image pro plus6.0测量积分光密度(IOD)和面积(Area)并计算出平均光密度(OD)，OD＝IOD/Area。
采用SPSS 18.0软件处理数据，用Prism 6.0软件进行作图，用Image pro plus软件分析免疫组织化学平均光密度。计量资料用(Mean±SD)表示多组均数比较，各组均数间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，TER值分析采用重复测量多因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。
应用Ussing Chamber检测各组大鼠近端结肠黏膜的TER值。发现近端结肠黏膜在Ussing Chamber上稳定10 min后，丁酸组和对照组近端结肠黏膜的TER值在120 min内都呈现出逐渐下降的趋势。尤氏灌注系统发现丁酸组在0、30、60、90、120 min的TER值分别为(70.65±5.03)Ω·cm2、(72.40±5.58)Ω·cm2、(68.84±5.02)Ω·cm2、(64.64±4.64)Ω·cm2和(58.95±6.23)Ω·cm2，生理盐水对照组分别为(63.56±4.28)Ω·cm2、(59.31±4.07)Ω·cm2、(51.73±4.42)Ω·cm2、(45.28±5.18)Ω·cm2和(42.09±4.06)Ω·cm2，空白对照组分别为(59.99±4.21)Ω·cm2、(56.64±3.71)Ω·cm2、(51.53±4.00)Ω·cm2、(48.01±7.40)Ω·cm2和(45.41±10.00)Ω·cm2。丁酸组各时间点TER值与生理盐水对照组及空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.001，图1)，生理盐水对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
注：TER，跨上皮电阻
与空白对照组相及生理盐水对照组相比，丁酸组Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达水平都有明显升高(P均<0.001，图2、表1)；空白对照组与生理盐水对照组相比三种蛋白差异无统计学意义(P＝0.974、0.968和0.459)。
三组ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达情况(Mean±SD)
三组ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白的表达情况(Mean±SD)
| 组别 | 例数 | ZO-1 | Occludin | Claudin-1 |
|---|---|---|---|---|
| 丁酸组 | 9 | 1.50±0.10 | 1.03±0.05 | 2.02±0.21 |
| 空白对照组 | 8 | 0.70±0.04a | 0.73±0.05a | 1.04±0.06a |
| 生理盐水对照组 | 8 | 0.75±0.05a | 0.74±0.08a | 1.06±0.09a |
注：与丁酸组比较，aP<0.001
免疫组织化学结果显示，丁酸组近端结肠组织中ZO-1和Occludin蛋白主要沿着肠黏膜上皮连续分布，染色排列紧密，边缘光滑，染色深；空白对照组和生理盐水对照组染色较浅，表达分布不均匀，有中断现象(图3)。
对照组和丁酸组Occludin和ZO-1蛋白平均光密度值见表2。结果丁酸组Occludin蛋白平均光密度显著高于空白对照组(P＝0.001)及生理盐水对照组(P＝0.001)，空白对照组与生理盐水对照组之间差异无统计学意义(P＝1)。丁酸组ZO-1蛋白平均光密度也显著高于空白对照组(P<0.001)及生理盐水对照组(P<0.001)，空白对照组和生理盐水对照组间差异无统计学意义(P＝0.963)。
三组Occludin和ZO-1蛋白免疫组织化学OD值(Mean±SD)
三组Occludin和ZO-1蛋白免疫组织化学OD值(Mean±SD)
| 组别 | 例数 | ZO-1 | Occludin |
|---|---|---|---|
| 丁酸组 | 9 | 0.22±0.04 | 0.26±0.04 |
| 空白对照组 | 8 | 0.16±0.01b | 0.21±0.02c |
| 生理盐水对照组 | 8 | 0.16±0.02b | 0.21±0.02c |
注：与丁酸组比较，bP＝0.001，cP<0.001
肠黏膜屏障是肠道非常重要的一道屏障，由完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞间的连接构成，紧密连接(tight junction，TJ)是细胞间最重要的连接方式之一。其功能是防止细菌和毒素侵入，允许水、离子和营养物质的渗透。诸多紧密连接蛋白中，尤以Occludin及Claudins最为重要。Occludin和Claudins是通过ZO与细胞骨架连接的主要跨膜蛋白，共同保持紧密连接结构的完整性；Occludin作为肠黏膜机械屏障紧密连接的主要蛋白具有重要功能，其表达变化可引起肠黏膜屏障功能障碍，引发细菌移位[10,11,12,13]。目前，肠上皮细胞屏障的破坏与多种疾病的发生有关，如：炎症性肠病、脓毒血症、重症胰腺炎等，在儿童急慢性疾病的发生发展中也具有显著意义。
短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)主要包括丁酸、丙酸、乙酸，由肠道内未消化的碳水化合物和蛋白质经细菌酵解而生成[14]。其中丁酸，是结肠上皮细胞的主要能量来源，是调节结肠黏膜屏障的重要分子[15,16]。丁酸还被发现在细胞间连接完整性中起主要作用[17]。NEC具有高发病率和死亡率，仍是影响全球早产儿最常见的胃肠道疾病[18]。以往临床对于新生儿坏死性小肠结肠炎的最佳处理方式是手术治疗，但大量的随访显示，手术患儿不仅受到的创伤大，且术后对患儿的正常生理机能及智力发育都会造成不良的负面影响[19,20]。导致NEC发展的因素包括肠屏障功能，肠道消化与运动和肠道免疫系统发育不成熟[21]。如能找到一种调节哺乳期肠黏膜屏障功能的关键因素，减少或避免肠屏障损伤，可大大减少NEC的发生。
本实验以生后7 d的新生鼠为实验对象，连续给予丁酸干预，结果发现0.2 ml/10 g的160 mmol/L丁酸作用下肠黏膜的TER值升高，说明适当浓度的丁酸能降低肠道通透性，增强肠黏膜屏障功能。进一步研究发现丁酸作用后黏膜上皮ZO-1、Occludin、Claudin-1等蛋白的表达水平升高，ZO-1蛋白和Occludin蛋白在肠上皮细胞间的表达和分布增加，推测丁酸可通过影响紧密连接蛋白的表达而增强肠上皮屏障，发挥其保护作用。
本研究阐明丁酸增加肠上皮紧密连接蛋白的表达来增强肠黏膜屏障功能，为防治NEC等肠道疾病及新生儿营养调控提供新的实验依据，有潜在应用价值。丁酸进入细胞后通过各种信号途径调节TJ的组装，中间涉及多种途径，如胆固醇富集微区、AMPK途径、磷脂酰肌醇-3和Gp蛋白途径等，何为关键机制，有待今后进一步阐明。
所有作者均声明不存在利益冲突
