探讨核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HnRNP)在肾母细胞瘤中的表达及其与肿瘤细胞增殖、凋亡的关系。
对3例肾母细胞瘤组织进行全转录组测序了解肿瘤差异表达基因，对差异基因进行GO分析和KEGG分析，并用qPCR检测验证HnRNPL在肾母细胞瘤中的表达情况。采用siRNA干扰肿瘤细胞HnRNPL的表达，设置转染组(转染siRNA)、空白组(不转染siRNA)及阴性对照组(转染NC-siRNA)，用qPCR及Western Blot检测干扰后HnRNPL、P53和BCL2基因及蛋白的表达情况，用MTT法和流式细胞术检测干扰后肿瘤细胞的增殖及凋亡情况。采用RNA免疫共沉淀检测HnRNPL蛋白与P53 mRNA的相互作用关系。
全转录组测序显示肾母细胞瘤组织中有748个基因差异表达。通过GO功能显著性富集分析发现：差异基因参与的生物进程主要是生化活动调节、细胞增殖、系统分化、RNA多聚酶Ⅱ转录调节等。通过KEGG显著性富集分析发现：差异基因参与的与肿瘤进程相关的信号通路主要是白细胞跨内皮迁移信号通路、p53信号通路、肿瘤转录调控异常等。qPCR检测证实HnRNPL在肾母细胞瘤组织中表达上调，与芯片测序结果一致。HnRNPL-siRNA干扰肿瘤细胞后，qPCR检测显示转染siRNA组的HnRNPL、p53和Bcl2mRNA相对表达量分别为0.348 5±0.019 7、0.248 5±0.035 5和0.372 2±0.014 2，阴性对照组分别为1.143 1±0.071 6、0.976 1±0.118 6和0.906 0±0.032 3，空白对照组分别为1.198 0±0.126 3、1.008 3±0.112 3和1.013 1±0.106 7，转染组与阴性对照组和空白对照组的组间差异有统计学意义(P<0.05及P<0.01)。Western Blot检测显示siRNA转染组中HnRNPL、p53和Bcl2蛋白相对表达量分别为0.131 5±0.005 7、0.466 2±0.043 3和0.185 1±0.023 1，阴性对照组分别为0.370 2±0.006 2、0.744 4±0.020 6和0.846 3±0.002 0，空白对照组分别为0.399 9±0.023 4、0.819 3±0.020 1和0.993 5±0.058 7，转染组与阴性对照组及空白对照组比较，差异有统计学意义(P均<0.05)。MTT法检测显示siRNA转染组肿瘤细胞的生长曲线24、48和72 h的吸光度分别为0.457 5±0.061 2、0.552 7±0.033 2和0.662 5±0.005 7，阴性对照组分别为0.653 3±0.011 2、0.797 4±0.002 1和0.901 1±0.014 7，空白对照组分别为0.687 9±0.013 2、0.813 4±0.023 1和0.913 1±0.071 2，转染组各个时间段与阴性对照组和空白对照组之间差异均有统计学意义(P均<0.05)。流式细胞术检测结果显示，siRNA转染组肿瘤细胞凋亡率为(37.57±2.39)%，远高于空白对照组(2.01±0.33)%及阴性对照组(3.46±0.41)%，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。RIP检测显示，HnRNPL蛋白能与p53 mRNA相互作用。
HnRNPL可能通过与p53 mRNA特异性的结合调控P53的表达，并通过p53相关信号通路参与了肿瘤细胞的增殖与抗凋亡过程。
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肾母细胞瘤是儿童泌尿系统中常见的恶性肿瘤，随着医疗技术的进步，目前其生存率已达90%以上，但仍有部分患儿由于术后复发、转移及对化疗药物的不敏感导致疗效不佳而死亡[1]。因此，研究肾母细胞瘤发生发展的相关机制，寻找与肿瘤细胞生物学行为密切相关的分子标志物，不仅能了解肿瘤的生物学过程，还能为肿瘤的靶向治疗提供参考。本研究通过对儿童肾母细胞瘤组织样本行全转录组测序，检测核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HnRNP)在肾母细胞瘤中的表达情况，进一步研究其与肿瘤细胞增殖凋亡的关系，探讨其在肿瘤发生发展中的作用机制。
Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Solexa测序芯片(上海吉因生物科技有限公司)；Taq DNA polymerase[宝生物工程(大连)有限公司]；Real time PCR Maste Mix(SYBR Green) [宝生物工程(大连)有限公司]；RIP Immunoprecipitationkit(美国Millipore公司)；兔抗人HnRNPL、p53、Bcl2、β-actin单克隆抗体(英国Abcam公司)，山羊抗兔二抗(北京中山金桥生物工程有限公司)。
肾母细胞瘤组织样本及相应瘤旁正常肾组织冷冻标本为重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科手术切除后保存。3例均为男孩，平均年龄2岁6个月，术前均未接受放化疗、生物治疗等干预措施。肾母细胞瘤细胞株G401购自北京协和细胞资源中心，肿瘤细胞生长于含10%胎牛血清培养液中，置37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，隔天观察传代。
标本送至上海吉因生物科技有限公司行全转录组测序。对变化差异明显的基因行生物信息学分析，包括GO功能注释和KEGG信号通路分析，并用qPCR检测验证HnRNPL在肾母细胞瘤中的表达情况。
HnRNPL-siRNA及NC-siRNA Oligo委托上海吉因生物技术有限公司采用化学合成法合成，并保存在－20℃冰箱内备用。HnRNPL基因的干扰RNA序列正链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反链：5’-AUCUUAGAUUGAUCCAAGCTT-3’；阴性对照组正链：5’-ACUACUGAGUGACAGUAGATT-3’，反链：5’-UCUACUGUCACUCAGUAGUTT-3’。转染前24 h，取对数生长期的G401细胞用胰酶消化并计数，按1.5×105/孔接种细胞于6孔培养板中。siRNA转染试剂配制及转染操作均按照说明书进行。分别设置空白组(未转染siRNA)、阴性对照组(转染NC-siRNA)及siRNA转染组(转染HnRNPL-siRNA)。
HnRNPL-siRNA转染48 h后，分别收集空白组、阴性对照组和转染组各组细胞提取细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度，按照说明书逆转录成CDNA，进行qPCR检测。其中HnRNPL、P53、BCL2及GAPDH基因的引物序列见表1。
HnRNPL、P53、BCL2及GAPDH基因的引物序列
HnRNPL、P53、BCL2及GAPDH基因的引物序列
| 基因 | 引物 |
|---|---|
| HnRNPL | 正链：GCTATGTGGTGGTAATGCCTAA |
| 反链：ATAAATGGGGTTCAGGATGGTA | |
| P53 | 正链：GGCCCACTTCACCGTACTAA |
| 反链：GTGGTTTCAAGGCCAGATGT | |
| Bcl2 | 正链：GGATGCCTTTGTGGAACTGT |
| 反链：AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT | |
| GAPDH | 正链：GTCAAGGCTGAGAACGGGAA |
| 反链：AAATGAGCCCCAGCCTTCTC |
HnRNPL-siRNA转染48 h后，按照细胞蛋白提取试剂盒说明书操作步骤，提取各组细胞蛋白并测定总蛋白含量，用Western blot方法测定HnRNPL、P53和BCL2蛋白的表达水平，用Quantity One 4.3.1软件对照片进行分析。
将转染细胞以每孔104个细胞接种于96孔板中，每孔体积100 μl每组6复孔，在37℃，5% CO2及饱和湿度的孵箱培养中使细胞贴壁。分别于培养后0、24、48、72 h，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，培养箱继续孵育4 h，终止培养，小心弃去孔内培养上清液，加入DMSO 150 μl，振荡10 min使结晶完全溶解。选择490 nm波长，在紫外分光光度计上测定各孔吸光度。设与试验孔平行不加细胞只加培养液的空白对照孔，实验重复3次，记录结果，以时间为横轴，吸光度(A490)为纵轴绘制细胞生长曲线。
HnRNPL-siRNA转染48 h后，消化收集各组细胞，用PBS洗涤2次，离心，弃上清，加入200 μl的结合缓冲液悬浮细胞后，再加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，室温避光孵育10 min，流式细胞仪检测，实验重复3次。
RIP实验按照说明书进行。首先配置完全细胞裂解液裂解细胞，并将细胞裂解液放置于－80°C备用。连接抗体和磁珠并配置抗体-磁珠悬液，将悬液与化冻后的样品混匀，摇床4°C过夜孵育。免疫共沉淀完成后，将悬液放置于磁力架，并用洗涤缓冲液洗涤6次。最后收集免疫共沉淀产物，并提取RNA，反转录成cDNA，实时定量PCR进行检测。
采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，实验数据均用Mean±SD表示，组间采用One-Way ANOVA分析，检验水准为P＝0.05。
3例肾母细胞瘤术后病理检查示2例为间变型，1例为非间变型。全转录组测序显示肿瘤组织中有328个差异性基因表达上调，420个差异性基因表达下调。差异表达基因层次聚类热图分析表明肿瘤组织中基因表达变化模式类似(图1)。qPCR证实在肾母细胞瘤组织中HnRNPL mRNA表达上调，与芯片测序结果一致(图2)。
注：N1、N2、N3为瘤旁正常组织，T1、T2、T3为肿瘤组织
注：**，与瘤旁组织比较，P<0.01；***，与瘤旁组织比较，P<0.001
GO功能显著性富集分析显示，差异表达mRNA参与的生物进程显著富集的包括生化活动调节、细胞增殖、系统分化、RNA多聚酶Ⅱ转录调节等。KEGG显著性富集分析显示，差异表达mRNA参与的与肿瘤进程相关的显著富集信号通路主要包括白细胞跨内皮迁移信号通路、p53信号通路、肿瘤转录调控异常等。
siRNA转染组HnPNPL、p53和Bcl2的mRNA表达水平低于空白组及阴性对照组，组间比较，差异有统计学意义(P<0.01和0.05，表2)。空白组与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。
不同时间点各组HnPNPL、p53和Bcl2的表达情况(Mean±SD)
不同时间点各组HnPNPL、p53和Bcl2的表达情况(Mean±SD)
| 组别 | 时间点 | HnPNPL | p53 | Bcl2 |
|---|---|---|---|---|
| 空白组 | HnRNPL mRNA转染48 h后 | 1.198 0±0.126 3 | 1.008 3±0.112 3 | 1.013 1±0.106 7 |
| HnRNP沉默后 | 0.399 9±0.023 4 | 0.819 3±0.020 1 | 0.993 5±0.058 7 | |
| 阴性对照组 | HnRNPL mRNA转染48 h后 | 1.143 1±0.071 6 | 0.976 1±0.118 6 | 0.906 0±0.032 3 |
| HnRNP沉默后 | 0.370 2±0.006 2 | 0.744 4±0.020 6 | 0.846 3±0.002 0 | |
| siRNA转染组 | HnRNPL mRNA转染48 h后 | 0.348 5±0.019 7ab | 0.248 5±0.035 5ab | 0.372 2±0.014 2ab |
| HnRNP沉默后 | 0.131 5±0.005 7ab | 0.466 2±0.043 3ab | 0.185 1±0.023 1ab |
注：与空白组比较，aP<0.01；与阴性对照组比较，bP<0.05
siRNA转染组中HnRNPL、p53和Bcl2蛋白表达强度明显低于空白组及阴性转染组，差异具有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。
HnRNPL-siRNA转染24、48及72 h时转染组中肿瘤细胞生长明显受到抑制，与空白组和阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与空白组不同时间点比较，差异均无统计学意义(P>0.05，表3)。
HnRNP沉默后对各组细胞增殖的影响(Mean±SD)
HnRNP沉默后对各组细胞增殖的影响(Mean±SD)
| 组别 | 转染后即时 | 转染后24 h | 转染后48 h | 转染后72 h |
|---|---|---|---|---|
| 空白组 | 0.399 7±0.008 9 | 0.687 9±0.013 2 | 0.813 4±0.023 1 | 0.913 1±0.071 2 |
| 阴性对照组 | 0.353 2±0.002 3 | 0.653 3±0.011 2 | 0.797 4±0.002 1 | 0.901 1±0.014 7 |
| siRNA转染组 | 0.381 3±0.011 7cd | 0.457 5±0.061 2cd | 0.552 7±0.033 2cd | 0.662 5±0.005 7cd |
注：与空白组比较，cP<0.05；与阴性对照组比较，dP<0.05
HnRNPL-siRNA转染组凋亡率为(37.57±2.39)%，高于空白组(2.01±0.33)%和阴性转染组(3.46±0.41)%，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。
HnRNPL蛋白能与p53 mRNA直接相互作用(图3)。
注：M，标记；IgG，阴性对照；Input，阳性对照
肾母细胞瘤的发生发展是一个多基因、多阶段参与的复杂过程。RNA作为DNA与蛋白质之间生物信息传递的桥梁，所有表达基因的信息及其转录水平即为转录组。转录组是特定细胞或组织在某一发育阶段或功能状态下转录出的总RNA。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是解读基因组功能和揭示细胞或组织中分子组成必需的，并对理解机体发育和疾病病因具有重要作用。本研究应用高通量测序技术构建了肾母细胞瘤的RNA表达谱，发现有748个基因表达异常，进一步通过生物信息学分析发现：这些差异基因主要参与生化活动调节、细胞增殖、系统分化、RNA多聚酶Ⅱ转录调节等生物学过程；通过KEGG信号通路分析发现，差异基因主要涉及白细胞跨内皮迁移信号通路、p53信号通路、肿瘤转录调控异常等通路；通过qPCR证实HnRNPL在肿瘤组织中高表达，与测序结果相一致，说明测序结果是可信的，这为寻找肾母细胞瘤关键分子提供了有力的理论和实验依据。
核不均一性核糖核蛋白(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HnRNP)家族是一组调节前体mRNA分子的选择性剪接及mRNA转运、翻译和稳定性的多功能RNA结合蛋白。包括至少20个成员，命名从HnRNPA1到HnRNPU。HnRNPL属于HnRNP家族成员之一，文献报道HnRNPL与肝癌、肺癌、乳腺癌、食管鳞癌、结直肠癌、膀胱癌及胰腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关，其表达失调主要与促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、粘附等有关[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。研究显示，在肝癌细胞中干扰HnRNPL的表达后，肿瘤细胞增殖、迁移能力显著减低；在肺癌中，HnRNPL与含有外显子3的caspase-9前体mRNA优先结合，导致其降解，进而影响caspase-9 mRNA亚型的表达，最终调控非小细胞肺癌发生；在胰腺癌中，lncRNA uc.345可以上调HnRNPL的表达，沉默HnRNPL后lncRNA uc.345的促肿瘤增殖能力被抑制[12,13,14]。在本研究中，我们发现HnRNPL在肿瘤组织中表达升高，提示HnRNPL可能与肾母细胞瘤有关。我们进一步用siRNA干扰HnRNPL的表达后，检测到肿瘤细胞的增殖受到明显抑制，同时凋亡率也明显增加。这与既往的研究结果相符合，表明HnRNPL的确与肾母细胞瘤的发生发展密切相关，但具体的作用机制尚不明确。
本研究通过生物信息学分析显示差异基因主要涉及p53信号通路、肿瘤转录调控异常等通路。结合文献分析，我们发现p53在肾母细胞瘤发生发展过程中起到重要作用[15]。那么，HnRNPL促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡的作用与p53相关信号通路是否有关系？通过siRNA干扰实验我们发现：干扰HnRNPL后，HnRNPL、p53和Bcl2的mRNA及蛋白表达水平出现一致性下调，提示HnRNPL和p53之间可能存在某种调控关系。HnRNPL作为mRNA前体分子的剪接因子，是否参与了P53的转录调控？我们进一步通过RNA免疫共沉淀实验发现，HnRNPL能够与p53 mRNA特异性的结合，推测HnRNPL可能作为RNA结合蛋白，参与了p53 mRNA前体分子的选择性剪接以及mRNA转运、翻译等生物学过程。p53是重要的抑癌基因，多种恶性肿瘤常伴有p53的突变，及大量突变型p53(mutant p53, mp53)蛋白的聚集。研究发现，75%的间变型肾母细胞瘤中存在Tp53基因突变；且组织分型良好的肾母细胞瘤中若发生p53基因突变，可进展为组织不良型[16,17,18]。p53基因突变后，mp53蛋白将获得新的功能，这些变化被称作mp53的获得性功能，如促进肿瘤细胞增殖、增强肿瘤的抗凋亡能力、提高化疗耐药性等[19,20,21]。本研究中p53的表达受HnRNPL的调控，并与肿瘤细胞的增殖及凋亡状态保持一致，提示在肾母细胞瘤中p53可能发生了突变或存在转录后修饰等改变，进而获得了新的功能，促进了肿瘤的发生发展。
综上所述，肾母细胞瘤中HnRNPL可能通过与p53 mRNA特异性的结合，作为RNA结合蛋白调控P53的表达，并通过p53相关信号通路参与了肿瘤细胞的增殖与抗凋亡过程。这为我们进一步探寻肾母细胞瘤的发病机制及其治疗靶点提供了新的思路和实验依据。但本研究中用于测序的组织样本偏少，需进一步在更多组织样本及细胞株中研究目标基因的表达及其与p53异常功能状态间的关系。
所有作者均声明不存在利益冲突
