微丝作为软骨细胞的细胞骨架的组成之一，主要由肌动蛋白组成。在软骨细胞中，微丝参与维持软骨细胞形态和结构、进行胞内信号转导和机械转导，影响软骨细胞发育。微丝的聚集、排列及分布受到多个信号通路调节，其中Rho GTP酶发挥重要作用，内源性或外源性的机械信号通过跨膜蛋白、离子通道等激活Rho GTP酶，调节肌动蛋白。而细胞极性则是指细胞形态、细胞膜、细胞骨架以及细胞器的分布等的不对称性，可调控细胞的分化、迁移和旁分泌，其中细胞骨架的极性是细胞极性最重要的特征，其极性的改变可以影响细胞极性。在软骨细胞发育过程中，伴随着极性的形成，是软骨细胞成熟的标志，对关节稳态的维持十分重要。目前与软骨细胞极性形成有关的研究较少，研究表明，TGF-β相关信号通路参与椎间盘和生长板的软骨细胞极性形成，但在关节软骨细胞中尚无类似报导。本文将对调节Actin的信号通路和调节细胞极性形成的信号通路进行综述，并试图阐明两者在软骨发育中的作用。
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微丝是细胞骨架的组成成分之一，主要由肌动蛋白(actin)组成，在软骨细胞中，actin参与维持软骨细胞的形态和结构，介导信号转导和软骨细胞的正常发育，许多信号通路能够调节actin，尤其是Rho GTP酶相关信号通路。细胞极性是指细胞形态、细胞膜、细胞骨架以及细胞器的分布等的不对称性，可调控细胞的分化、迁移和旁分泌，其中细胞骨架的极性是细胞极性最重要的特征，actin在空间上的分布、排列，即actin的极性的改变可以影响细胞的极性。作为有极性的软骨细胞，极性形成对于骨骼的正常发育至关重要，影响软骨细胞的形态、大小和方向的特征性变化。目前研究表明，TGF-β相关信号通路可以调节椎间盘软骨和生长板软骨细胞的极性，进而影响软骨的发育，但在关节软骨中尚无相关报道。本文拟通过对调节actin和极性的信号通路进行综述，试图阐述两者在软骨细胞发育中的作用。
哺乳动物的细胞骨架是由微丝(microfilaments，MF)，微管(microtubule，MT)和中间纤维(intermediate filament，IF)组成的三维结构，影响细胞形态、物质运输、细胞分裂，还能感受机械应力和周围环境的机械特性，外界机械应力可以引起细胞骨架的重排，进而影响细胞功能[1]。微丝也称肌动蛋白丝(actin filament)，主要由actin组成，actin是分子量为43×103u的球形蛋白，在真核细胞中含量最为丰富，由α、β、γ三种单体组成，能水解ATP提供能量[2]。肌动蛋白结合蛋白(actin binding proteins, ABPs)在actin聚合、解聚和分布中发挥了重要作用，影响微丝的形成、机械转导和actin动力学[3]。生理情况下，球状肌动蛋白单体(G-actin)在ATP供能、ABPs辅助下，经成核期、延长期和平衡期聚合形成纤维状肌动蛋白(F-actin)，最终形成螺旋形的微丝[2]。
微丝可以为细胞提供机械支持，在改变细胞形态、细胞迁移和粘附、细胞器移动、感知环境张力变化、内吞、细胞分裂等方面也发挥重要作用[4]。
微丝主要分布在细胞膜下，与软骨细胞的生物机械特性密切相关[2]，可调节软骨细胞形态维持其表型，保持软骨细胞的机械完整性以承受应力，影响其粘弹性、刚度，还能对化学、机械刺激做出反应[5]。
在软骨细胞的发育过程中，细胞从成纤维形逐渐转化为球形或多边形，基因表达也发生变化，这些变化常与actin的重组有关[6]。在体外，星形的软骨前体细胞过渡到球形的软骨细胞过程中，细胞形态发生改变，平行的actin应力纤维束转化为细胞膜下的actin网[7]。
actin经黏着斑与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)相连，参与信号转导，引发下游生物合成反应[8]，参与调节软骨细胞的分化、代谢、基质重塑以及对机械刺激的反应[9]。细胞膜的离子通道、整合素、钙黏蛋白、纤毛等接受外界生物力学刺激，进行机械转导[10]，通过下游的细胞骨架、激酶等途径将机械信号转化为生化信号传递到核内，引起应答，其中整合素-细胞骨架系统起重要作用[11]。当机械信号从ECM传递到整合素时，形成蛋白复合物，即黏着斑，触发细胞内的信号级联[10]。整合素介导的粘附可诱导FAK自我磷酸化，与Src结合形成FAK-Src复合体，活化后可激活Rac1、Cdc42和RhoA[12]，进而调节Actin的聚合和解聚。此外，actin还可通过直接机械偶联，将作用于细胞表面的机械力传导到细胞核，该过程可更快地诱导核内的生化事件[13]。
软骨细胞由间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化而来，MSCs形态与成纤维细胞相似，呈梭形，有自我复制和多向分化潜能，可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等。软骨细胞的分化涉及细胞形态和基因表达的变化，在特定环境下可诱导MSCs向软骨细胞定向分化[14]。ECM的生物和机械特性调节MSCs分化，外界机械应力(如静水压力、周期性拉力)也影响MSCs的分化结局[10]。机械应力可以调节整合素与ECM的亲和力，促进机械转导；在机械转导过程中，机械应力通过Rho-GEFs和Rho-GAPs调节Rho GTP酶，参与actin的重塑[15]。在外界机械应力刺激下，actin的分布和结构发生变化，引起细胞形态、生物学特征的变化，进而影响MSCs分化[12]。比如，在直流电场力或微重力作用下，细胞内的应力纤维、黏着斑减少，可诱导MSCs向软骨细胞或脂肪细胞定向分化[16]。
Rho GTP酶是Ras超家族成员之一，GEFs、GAPs、GDIs可以调节Rho GTP酶活性型和失活型的相互转化。Rho GTP酶的活化可调节actin，进而控制细胞的形态和运动。RhoA, Rac1和Cdc42是最常见也是目前研究最为广泛的Rho GTP酶，活化后可以调节伪足、应力纤维、收缩环的形成。
在软骨细胞中，ECM的信号和外界机械应力经由Rho GTP酶传递到Actin，引起actin的变化，调节细胞的激活[17]。
目前已知，ECM的信号和外界机械应力可以活化多种跨膜信号分子，进而激活Rho GTP酶，其中对G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinesis，RTKs)、整合素、TGF-β受体的研究较为广泛。
GPCRs与配体结合后，发生构象改变，激活G蛋白(由α、β、γ组成的异三聚体)，进而激活下游的RhoA和Rac1[18]。
RTKs由三部分组成：与配体结合的胞外结构域，单次跨膜的疏水α螺旋区，有酪氨酸激酶(tyrosine protein kinase，TPK)活性的胞内结构域。与配体结合后，部分RTKs可以通过Rho GEFs激活Rho GTP酶，包括RhoA、Rac1和Cdc42 [19]。
整合素是由α和β两个亚基组成的异二聚体，是连接ECM和胞内Actin的跨膜受体，介导细胞-ECM粘附形成。整合素与配体结合后被激活，招募大量蛋白质，在其胞内结构域组装成各种粘附结构[20]。整合素介导的粘附招募和磷酸化一系列下游蛋白激活RhoA、Rac1和Cdc42[12]。
TGF-β超家族包含30多种分泌型细胞因子，包括骨形态发生蛋白(BMP)，生长分化因子(GDF)、激活素(activins)和TGF-β等[21]。TGF-β与受体结合，经Smads或非Smads通路对细胞的各种功能进行调节[22]。Smads通路的核心元件包括TGF-β受体(TGFβR，分为TβRI和TβRII)和下游Smad转录因子。TGFβR与配体结合后，磷酸化下游的R-Smads(Smad2/3)，两个R-Smads与Smad4结合形成三聚体，进入细胞核内，调节基因表达[23]。而在非Smads信号通路中，活化的TGFβR可激活MAPKs、PI3K/Akt、JAK/STAT、小GTP酶，这些信号分子可独立执行其功能，也可作用于Smads，调节TGF-β/Smads通路[22]。TGF-β可经Smads和非Smads信号通路调节RhoA/ROCK的活性[24]，在极化上皮细胞中，TGF-β可经非Smads通路激活RhoA、Rac1和Cdc42，还可经Smads信号通路调节RhoA的活性[24]。
Rho GTP酶被激活后，通过下游的效应分子，如ROCK、Formins、Arp2/3复合体、P21活化的蛋白激酶1(p21-activated protein kinase 1, PAK1)，影响Actin。
RhoA在软骨细胞中主要调节应力纤维以及黏着斑的形成。应力纤维为肌动球蛋白，由反向平行的微丝通过肌球蛋白交联形成。活化的RhoA激活下游信号分子ROCK，通过一系列信号分子提高肌球蛋白收缩力，稳定现有微丝并促进其聚合[17]。mDia是Formins家族的一员，其中的mDia1可以被RhoA、Rac1和Cdc42部分活化，诱导G-actin成核，形成不分支的微丝[25]。RhoA作用于mDia和ROCK，共同促进应力纤维形成。
Formins和Arp2/3复合体都是ABPs，都可促进G-actin成核。不同的是，Formins还能抑制加帽蛋白的作用，且Fromins通过诱导G-actin成核，可促进微丝(不分支)延长[3]，参与丝状伪足的形成。而Arp2/3复合体诱导G-actin在原有微丝侧面成核，促进分支的微丝组装，且该过程需要成核促进因子(nucleation promoting factors, NPFs)辅助[3]。在移行细胞前缘，分支的微丝可以促进板状伪足的形成[26]。活化的Rho GTP酶可以作用于Formins或NPFs的特定位点，促进微丝组装[27]。
PAK1为丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，与活化的Cdc42或Rac1结合后被激活，调节Actin动力学，参与细胞形态、细胞迁移、粘附和伪足形成的调节[28]。
在整个软骨发生过程中均有Rho GTP酶的表达，随着软骨细胞分化成熟，RhoA的活性逐渐下降，而Cdc42和Rac1的表达逐渐增加。RhoA过表达可以抑制早期软骨发生和肥大转化，相反，Cdc42和Rac1则促进肥大转化[17]。
细胞极性是指细胞形态、细胞膜、细胞骨架以及细胞器的分布等的不对称性，对于组织功能和胚胎发育至关重要。极性是细胞控制形态、粘附和细胞器分布的内在机制，对于调控细胞的分化、迁移和旁分泌发挥重要作用[29]。细胞骨架的极性是细胞极性的最重要特征[30]。G-actin具有极性，聚合过程中头尾相接，故微丝也具有极性，聚合过程中正极组装快，负极组装慢；解聚过程中负极解聚较快，正极解聚较慢[30]。微丝的极性具体体现在4个方面：肌动蛋白单体、单个微丝、微丝间的相对方向、微丝在细胞中的分布[30]。因此微丝的组装、排列和空间分布受到影响，也会相应的改变细胞骨架极性，引起细胞极性的变化。
细胞的极性形成在肾脏、消化系统、呼吸系统及神经系统疾病[31]等研究领域正逐渐受到重视，但在软骨细胞中相关研究较少。在极化的上皮细胞中，骨架蛋白的分布和方向，参与细胞正常形态的发生和维持；相反，细胞形态也影响骨架蛋白的分布和方向[32]。在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal tran-sition, EMT)过程中，上皮细胞失去极性，获得转移和侵袭的能力[23]，其机制主要为两方面：一方面，TGF-β/Smad4可直接激活EMT主要转录因子的表达，促进EMT[23]；另一方面，在TGF-β刺激下，Filamin B-Refilin复合体形成，微丝的分布和结构发生变化，诱导EMT[33]。
与上皮细胞相似，软骨细胞也具有极性，其极性的形成不仅是软骨细胞功能成熟的标志，也是维持关节软骨稳态的必要条件[34]。软骨细胞的极性对于骨骼的正常发育至关重要，影响软骨细胞的形态、大小和方向的特征性变化，极性破坏可导致发育不良[35]。软骨细胞分化成熟过程中，细胞从成纤维形逐渐转化为球形或多边形，细胞极性发生改变，微丝的分布和结构也发生改变。而在软骨细胞去分化过程中，最典型的特征是细胞形态的改变和Actin的变化[36]。
目前研究表明，在椎间盘软骨和生长板软骨中，TGF-β通过不同的下游效应分子作用于骨架蛋白，参与软骨细胞极性形成，但在关节软骨中，TGF-β与软骨细胞极性形成之间的关系尚无相关报导。
TGF家族配体是最普遍的极性细胞内感受器，TGF/Smad4信号通路在生长板软骨细胞极性调节中发挥重要的作用[35]。TGF配体位于软骨细胞表面，缺乏TGF配体的小鼠会出现类似人类软骨发育不良表现，提示TGF信号通路在软骨细胞形态发育及维持中发挥的作用[37]。Smad4是TGF-β的下游效应分子，在缺乏Smad4小鼠体内，软骨细胞的形态、大小和方向的特征性变化，即细胞的极性受到影响，生长板的结构也受到破坏[35]。
而在椎间盘软骨中，TGF-β经Filamin-B—Refilin轴调节软骨细胞中微丝的分布和结构，影响细胞极性，从而对骨骼发育进行调节。Filamin家族属于ABPs，可以促进细胞膜下actin网的形成，连接胞膜蛋白与actin，是actin机械转导的中心元件[38]。其中Flamin-B(FLNB)在骨骼发育过程中发挥重要作用，FLNB缺乏的小鼠椎间盘软骨细胞异常分化为肥大软骨细胞，导致异位骨形成和椎间融合。该表型与Smad2和Smad3介导的TGF-β信号通路上调相一致，提示FLNB在软骨细胞分化和骨骼发育中可能抑制TGF-β/Smad信号转导[39]。Refilin是TGF-β的下游效应分子，与Filamin家族相互作用，促进顶端actin束的形成[40]，Rfln DKO(double knockout)的小鼠出现与FLNB缺乏小鼠相似的骨骼畸形，即椎间盘缺损，椎骨融合和长骨生长的延迟[33]。Rfln DKO的小鼠和FLNB敲除的小鼠，均出现Actin动力学失调，对细胞迁移、分化和发育产生类似影响[33]。
如前述，TGF-β可经Smads和非Smads通路调节RhoA/ROCK的活性，影响微丝的聚集和解聚，还参与椎间盘软骨和生长板软骨细胞极性形成的调节，但在关节软骨细胞中，TGF-β与Actin之间有无类似的关系，这种关系是否与极性形成有关仍需进一步研究。
细胞骨架的极性是细胞极性最重要的特征，而微丝作为细胞骨架的构成成分之一，其基本组成单位actin的极性可以受到外界机械应力的调节，这一过程中有许多信号通路的参与，其中Rho GTP酶发挥重要作用。作为有极性的软骨细胞，其极性的形成对于骨骼的正常发育至关重要，极性破坏可导致发育不良。目前已有研究证明，生长板软骨和椎间盘软骨极性形成过程中受到TGF-β相关信号通路的调节，但尚无关节软骨与极性形成的相关报道。发育性髋关节发育不良(developmental dysplasia of the hip, DDH)是小儿最常见的下肢畸形之一，目前治疗方式仍存在争议，延迟治疗可引起关节功能不可逆的形态失常，最终不可避免发生骨关节炎，严重影响患儿的生活质量。目前已知异常应力是DDH的明确诱因，治疗后髋臼软骨细胞进一步的发育能力关系到患儿愈后，越早的实现股骨头与髋臼的复位，髋臼软骨发育至正常的潜能越大，但这种可恢复的发育能力，即髋臼软骨重塑的机制尚未明确。课题组在前期的实验中，通过观察异常应力及去除异常应力后髋臼软骨的组织形态学结果显示，随着髋臼异常应力的时间延长，发育不良髋臼软骨细胞排列紊乱，形态明显由正常的立方形或六角形变为短梭形且排列无序；当特定时间内去除异常应力后，髋关节软骨细胞排列及形态均可恢复至接近于正常对照组。随着异常应力的时间延长，髋臼及软骨细胞的形态恢复能力越差，提示髋关节的发育早期髋臼软骨细胞形态及功能的失常，在一定的时间内具有重塑能力[41]。因此，进一步探讨髋臼软骨正常发育过程中是否与髋臼软骨细胞极性形成有关系，以及其中骨架蛋白Actin是否发挥作用。这有望揭示髋关节发育不良软骨可逆性改变的可能机制，为临床上早期治疗的时间点以及预后评估提供重要的实验数据和理论基础。
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