肠神经系统(enteric nervous system，ENS)主要起源于神经嵴细胞(neural crest cells，NCCs)，是周围神经系统的最大组成部分。虽然它与中枢神经系统一同调控许多胃肠道功能，但ENS也可以独立于中枢神经系统发挥作用。ENS发育的主要过程包括：神经嵴细胞离开神经管侵入发育中的肠道，并在其中增殖、定向迁移、向神经元和胶质细胞分化等。本综述总结了ENS发育的概况，重点关注最近在神经嵴细胞增殖、迁移、分化相关分子机制方面的研究进展。
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肠神经系统(enteric nervous system，ENS)是周围神经系统的最大组成部分，虽然它与中枢神经系统一同调控着胃肠道的许多功能，但ENS也可以独立于中枢神经系统发挥作用，因此常被称为"第二个大脑"[1]。ENS发育的主要过程包括：神经嵴细胞(neural crest cells，NCCs)离开神经管侵入发育中的肠道，并在其中增殖，定向迁移，向神经元和胶质细胞的分化；神经丛的形成；外源性神经纤维的植入；轴突和突触的发生等。这些过程中有些是同时发生的，需要特定的分子信号进行复杂精确的调控。如果这一过程发生一丝扰动都可能导致严重的肠神经疾病，比如先天性巨结肠(Hirschsprung's disease，HSCR)，其特征是由于NCCs无法完成迁移而导致远端肠道中没有神经节细胞[2]。本综述总结了ENS发育的概况，重点关注最近在神经嵴细胞增殖、迁移、分化相关分子机制方面的研究进展。
ENS由神经元和神经胶质细胞组成，他们共同构成了同心圆结构的神经丛。一个是肌间神经丛(Myenteric Plexus)，位于肠壁纵行肌层和环形肌层之间，它为两层肌层提供神经支配以控制蠕动。另一个为黏膜下丛(Submucosal Plexus)，位于黏膜上皮下，其功能涉及感觉腔内的环境，调节胃肠道血流，控制上皮细胞功能等[3]。需要注意的是，胃肠道任一区域都存在肌间神经丛，但黏膜下神经丛在食管中是不存在的，而且它其实是由一个外部的Schabadasch神经丛和一个内部的Meissner神经丛组成，由于它们广泛地相互连接，且没有功能上的区别，所以通常不做区分[4]。
ENS有三种细胞起源，包括毗邻第1～7体节的迷走神经嵴细胞、第28体节附近的骶神经嵴细胞以及沿着外来神经纤维迁入肠道的施万细胞(Schwann cell)前体细胞的一个亚群。以小鼠为例，迷走神经嵴细胞在胚胎期第8.5天离开神经管，在第9天到达前肠，此时称为肠神经嵴细胞(enteric neural crest-derived cells，ENCCs)，然后在肠道间质中从头向尾线性迁移，在胚胎期第13.5～14.5天定殖完整个肠道。其中ENCCs有一亚群在胚胎期第11.5～12.5天，未经过盲肠，而是通过肠系膜向毗邻的远端中肠和后肠迁移，这种跨肠系膜的迁移似乎是后肠远端三分之二区域ENS的主要来源[5]。ENCCs在此过程后还有一个"由外向内"的径向迁移，即肠肌间神经丛的ENCCs向上皮细胞放射状迁移，最终形成黏膜下神经丛。除鸟类黏膜下丛先发育外，其余所有物种肌间神经丛均先于黏膜下丛发育。斑马鱼没有黏膜下神经丛，而两栖动物和爬行动物仅在食管和胃有少量的黏膜下神经丛[4]。
骶神经嵴细胞在胚胎期第9.5天时离开神经管向外迁移，第11.5天到达泄殖腔区域。然后等待几天，当ENCCs到达后肠后，才继续沿着盆丛延伸的神经纤维进入远端后肠，从后往前迁移，这点与向肛门迁移的迷走神经嵴细胞正好相反。最后形成后肠中不到20%的神经元，绝大多数肠神经细胞还是来自迷走神经嵴[6]。迷走神经嵴细胞比骶神经嵴细胞侵袭性更高。Burns等[7]用迷走神经管替代骶神经管，发现迷走神经嵴细胞在后肠中定植的速度更快，数量也更多。还有一种假说认为是Slit2-Robo信号的作用，即近端肠道表达Slit2配体，在第8体节以后的神经嵴细胞则表达抑制性Robo受体，表达Slit2的肠道会排斥表达Robo受体的神经嵴细胞[8]。然而不同物种间又存在差异，斑马鱼中似乎不存在骶神经嵴细胞[9]。人类中的情况如何，则还需要进一步研究。
除迷走神经和骶神经嵴细胞在肠道内的迁移外，还有一个施万前体细胞亚群沿着外源性神经纤维迁移到后肠。这个来源的细胞对结直肠ENS的贡献高达20%[10]。此外，最近的遗传学研究认为，靠近第1，2体节的神经嵴细胞可产生施万细胞，正是这群细胞沿着迷走神经纤维下行迁移至食管和胃，并在这些区域产生肠神经系统[11]。
GDNF-RET信号通路是在ENS正常发育中最重要的信号通路，胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor，GDNF)作为配体在肠道间质中表达，并与ENCCs上的RET受体复合物结合。RET受体复合物由酪氨酸激酶受体RET和它的共同受体GFRα1-GFRα4组成，分别对应的配体为GDNF、Neurturin(NTN)、Artemin(ART)和Persephin(PSP)。
根据羧基端的酪氨酸残基不同，RET存在三种亚型，分别是RET9、RET43和RET51。四个关键的酪氨酸残基分别为Tyrosine 905(Y905)、Tyrosine 1015(Y1015)、Tyrosine 1062(Y1062)和Tyrosine 1096(Y1096)，是不同适配器蛋白的结合位点，负责启动RET激活后的下游级联信号，包括RAS/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、jun相关N末端激酶(JNK)，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)等。RET9和RET51是存在于大多数组织中的常见形式，其下游信号传导机制并不相同，只有RET51中存在Y1062[12]。Y1062介导了细胞内关键的RAS/MAPK和PI3K/AKT信号通路，沉默Y1062基因后，突变小鼠的表型类似于RET纯合子敲除小鼠的表型[13]。研究表明，PI3K信号介导了ENCC的迁移、增殖和存活[4]。例如，RAC1在板状伪足形成和细胞运动中起重要作用，PI3K可通过激活迁移波阵面上RAC1的表达来促进迁移[14]。此外，PTEN、Sprouty2和KIF26A是该通路的负性调控因子。PTEN通过将PIP3转化为PIP2来抑制PI3K的活性。有研究表明，PTEN的过表达减少了ENCCs在体外的迁移，而在敲除PTEN的小鼠中，又出现了肠道神经节细胞过度增生和巨结肠，所以为了维持高度迁移ENCCs亚群中足够的PI3K活性，迁移波阵面前PTEN的局部表达水平会有适当降低[15]。缺乏Sprouty2会导致神经节细胞过度增生、食管运动障碍和肠道运动缺陷[16]。KIF26A缺乏则会发展成巨结肠和神经节过度增生，并出现神经突的生长缺陷[17]。RET基因是HSCR的主要易感基因，在50%的家族性病例和7%～20%的散发性病例中均检测到RET突变[2]。
RET的激活还可促进ENCC前体细胞的增殖和存活。若想保证ENCCs在肠道的正常定殖，需要有充足的ENCCs前体细胞池。在RET缺乏的小鼠中，前肠的ENCCs大量凋亡，细胞池的不足导致远端肠道的无神经节细胞症[18]。RET对ENS发育的影响与其表达水平有关。RET基因纯合突变的小鼠表现出全部肠道基本无神经节细胞，而杂合突变的小鼠有正常ENS。当RET的表达降低到正常水平1/3左右时，会发生结肠的无神经节细胞症[19]。GDNF对ENCCs具有强大的化学趋化作用。在NCCs开始进入前肠或之前，前肠间质即开始表达GDNF mRNA；在胚胎期第9.5天，胃中富含GDNF mRNA；在第10.5天，GDNF mRNA延伸至盲肠，并在该区域达到最高水平。这表明至少在ENCCs通过盲肠前，GDNF的浓度梯度在促进ENCCs的迁移中起作用。ENCCs的跨肠系膜途径也依赖于GDNF-RET信号的活性，因为在缺少GFRα1表达的小鼠中这一过程不会发生[5,20]。
除此之外，GDNF-RET信号还可促进肠神经元分化，但关于该作用的文献报道有相矛盾之处。有研究证明GDNF杂合突变的小鼠表现出分化的增强。与此相反，也有研究发现缺乏GDNF信号会抑制神经元分化并维持ENCCs处于前体状态[21,22]。这反映了肠神经系统发育是个十分精细复杂的过程，有许多信号分子共同参与了调节。RET在发育后期仍在肠神经元亚群中表达，但其在出生后的功能仍有待研究[23]。
内皮素B受体(endothelin receptor B，EDNRB)是G蛋白偶联受体，在ENCCs与肠道间质均有表达。内皮素-3(EDN3)是一种在肠道间质中表达的由21个氨基酸组成的多肽，最初是一种无活性的前体形式，被内皮素转换酶-1(endothelin-converting enzyme 1，ECE1)裂解后才产生具有生物活性的EDN3。但EDN3、EDNRB和ECE1的缺失，都会导致结直肠无神经节细胞症[24]。EDN3和EDNRB的突变在散发的HSCR病例中占大约5%，且主要是短段型巨结肠[2]。小鼠中Edn3 mRNA以一种时空调控的方式在非常短的时间内表达。胚胎期第10天时，Edn3 mRNA在中肠中表达；第10.5天在盲肠中表达水平升高；第11天ENCCs迁移到盲肠时，Edn3 mRNA在后肠中表达[25]。在ENCCs到达盲肠之前，似乎并不需要EDNRB信号，这就解释了为什么该通路的缺失只会导致远端结肠无神经节细胞症。
EDNRB信号通路可促进ENCCs的增殖，并抑制其向神经元的分化。EDNRB的缺失会使ENCCs增殖减少和过早分化，这样细胞就无法继续分裂与迁移，最终导致肠内ENCCs定殖失败[26]。需要注意的是，EDN3是通过与GDNF协同促进ENCCs的增殖；另一方面，EDNRB与RET信号通路在神经元分化中又具有拮抗作用。GDNF可增加体外培养的ENCCs分化成神经元的数量，而在胶原凝胶上培养后肠外植体的实验证实，EDN3可以抑制神经元的分化[27]。
EDNRB信号通路也可以调控ENCCs的迁移。但在不同条件下，对ENCCs迁移的影响并不相同。一方面EDN3抑制GDNF对ENCCs的化学趋化作用，另一方面当RET信号失调时，EDN3能拯救部分结肠ENCCs的定殖[28]。有研究利用延时成像技术发现，如用BQ-788(一种选择性EDNRB拮抗剂)来处理结肠外植体，可观察到ENCCs迁移速度明显慢于对照组，并表现出与细胞增殖或分化无关的迁移行为缺陷，包括迁移轨迹和速度的改变[29]。近些年来有证据证明，EDN3也参与调节肠道细胞外基质的功能[30]。这些都提示间质中EDNRB信号可能是建立在允许ENCCs定植的结肠微环境的必要条件。
性别决定区Y型盒(Sex determining region Y-box，SOX10)是一类含有HMG box DNA结合结构域的转录因子，在NCCs离开神经管时即表达，帮助维持ENCCs前体细胞的生存。SOX10纯合突变的小鼠在出生前死亡，并表现出NCCs向前肠迁移的失败。在NCCs进入肠道后，SOX10负责激活RET与EDNRB信号通路，并维持ENCCs处于一种未分化的增殖状态，与EDNRB的作用类似[31]。ENCCs必须维持SOX10的表达，才能分化成胶质细胞，或下调SOX10水平，才能产生神经元[32]。在HSCR和Waardenburg-Shah综合征(WS4；HSCR 2型)的患者中均已经确认SOX10基因突变[33]。
类似配对同源基因2B(Paired like homeobox 2B，PHOX2B)是含有同源结构域的转录因子。已在HSCR患者中发现，且常与先天性中枢性换气不足综合征相关，参与神经发生并调节RET的表达[34]。PHOX2B对于所有自主神经节的形成是必不可少的，包括肠神经节。其作用是促进ENCC的增殖和生存，一旦缺失，会导致全肠无神经节细胞症[35]。PHOX2B与SOX10相互抑制是维持肠道神经元与胶质细胞平衡的重要机制。因为，SOX10帮助维持ENCCs的未分化状态，故在要分化为神经元的前体细胞中SOX10会下调，而这一下调是通过PHOX2B和ASCL1(MASH1)的蛋白产物实现的[25]。ASCL1在转录水平又可被Notch信号下游的HES1转录因子负调控[36]。研究人员对胚胎期第12.5天小鼠肠道表达SOX10细胞的单细胞RNA测序显示，发育肠道中的ENCCs不是同质的，至少有3种ENCCs前体细胞转录类型：一种靠近迁移波阵面的细胞协同表达PHOX2B、SOX10和RET，另两种沿着胶质细胞或神经源性谱系发散[37]。另外，对小鼠小肠中单个SOX10阳性的前体细胞后代的谱系追踪显示，RET是激活神经源性程序所必需的[38]。但目前的研究还无法解释SOX10和PHOX2B是如何与RET信号一起在维持前体细胞形态向神经元或神经胶质和其亚型的特化中发挥调控作用的。
其他在ENS正常发育中发挥作用的信号分子还有转录因子E盒结合锌指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)、心脏神经嵴衍生物表达转录因子2(heart and neural crest derivatives expressed 2，HAND2)、脑信号蛋白3A(semaphorin 3A，SEMA3A)、视黄酸(retinoic acid，RA) 、Hedgehog等。
其中，ZEB2起初被认为是转录抑制因子，在NCCs离开神经管上皮间质转化过程中发挥作用。ZEB2对正常的NCCs迁移至关重要，在Mowat-Wilson综合征(不同程度的颅面缺陷，智力障碍，有时伴有HSCR)患者中已识别出ZEB2的无义突变[39]。在ENS中，ZEB2和SOX10有着相似的表达模式。ZEB2在ENCCs、部分肠上皮间质以及胶质细胞中表达[40]。
HAND2是心肌发育、神经元分化、神经递质表达和肠神经节形成所必需的[41]。NCCs进入前肠后就表达HAND2，缺失HAND2的小鼠虽能完成ENS定殖，但表现出神经元分化受损，肠神经元数量减少[42]。
SEMA3A在肠间质中表达，可调节骶神经嵴细胞和外源性轴突进入远端后肠。SEMA3A至少在一定程度上导致了延迟，因为在缺乏SEMA3A的小鼠中，骶神经嵴细胞和外部轴突都过早地进入了远端后肠[43]。
RA是一种可扩散的形态因子，由视黄醛脱氢酶在迷走神经体节周围的间质产生，作用于迁移的NCCs上的核视黄酸受体α和γ。RA过多或缺乏都会导致ENS发育异常[44]。
Hedgehog包括Sonic hedgehog (SHH)和Indian hedgehog (IHH)。SHH在肠上皮细胞表达，通过改变微环境，比如影响Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅵ型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白来间接调节ENCCs的迁移[45]。ENCCs上表达SHH的受体，生长停滞特异性蛋白1(growth arrest specific protein1，GAS1)，SHH可抑制表达GAS1的ENCCs前体细胞，阻止这些前体细胞不适当地定殖黏膜及肠肌间神经丛分化的神经元过早地向上皮细胞延伸[46]。最近研究人员在一个大的HSCR家系中利用外显子测序技术发现了IHH的突变，并证明了缺失IHH的斑马鱼会表现出类似HSCR的表型[47]。
神经轴突导向因子(Netrins)由肠上皮细胞分泌，在ENCCs上表达其受体结肠癌缺失蛋白(deleted in colon cancer，DCC)。Netrins促进ENCCs从肠肌层向黏膜下区域迁移。在DCC突变小鼠中，没有黏膜下神经丛的存在[48]。
骨形态形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)，主要是其家族成员中的BMP2和BMP4，由肠上皮细胞分泌。在斑马鱼中，BMP2参与调节ENCCs的增殖、迁移和分化。Noggin是BMP的拮抗剂，在小鼠胚胎肠组织发育和外植体培养中，Noggin抑制BMP4信号从而增强了ENCCs的迁移，而鸡胚肠间质中过表达Noggin抑制了ENCCs的迁移。这可能与鸡胚与小鼠中黏膜下丛发育时机不同有关[49]。
肠道周围微环境在ENS的发育中也发挥了重要的作用。ENCCs表面表达了大量的细胞黏附分子来调节它们与ECM的相互作用。β1 integrin是ECM的主要受体，它在盲肠与ECM相互作用来改变细胞黏附，进而调控ENCCs的迁移[50]。此外，细胞黏附分子L1cam对于ENCCs迁移链的维持十分重要，它的缺失在早期发育过程中会导致迁移延迟，尽管最后ENCCs仍会定殖完整个肠道。体外干扰L1cam会导致ENCC迁移波阵面上部分链的断裂，产生更多孤立的ENCCs，使其沿肠道迁移更慢，导致结肠无神经节细胞症[51]。与之类似的还有胶原蛋白Ⅵ、胶原蛋白XⅧ (Col18)和集聚蛋白(Agrin)等黏附分子的作用逐渐被发现[52,53]。
综上所述，ENS的正常发育需要复杂的信号分子网络来实现。对动物模型及人类疾病的大量基础研究，已经逐渐阐明了NCCs在肠道中定植，迁移和增殖分化的行为模式，揭示了调控ENS发育的主要信号通路及其他一些信号分子。然而在ENS发育过程中，RET和EDNRB信号通路是如何分工合作，紧密配合的，肠道中不同来源的NCCs是否存在不同的迁移模式和调控机制仍需进一步研究。对于不断发现的新的信号分子，其作用机制，及其与经典信号通路又有什么内在联系，也有待进一步研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
