神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是一种源自神经嵴的神经内分泌肿瘤，也是儿童中最常见的颅外实体瘤。其高危患儿占比大且治愈率低，故治疗高危NB仍是当前的医学难题。在新型治疗方法的研究中，溶瘤病毒（oncolytic viruses, OV）疗法脱颖而出。OV是一种新型的肿瘤治疗方法，其可以特异性靶向NB而不影响正常组织，从而有效避免目前单靶点抗癌药物普遍存在的耐药性问题，因而在肿瘤治疗方面具有较大的优势，尤其是在治疗当前难以解决的高危神经母细胞瘤方面。溶瘤病毒对神经母细胞瘤的治疗效果十分可观，有望成为神经母细胞瘤的一线治疗手段。本文就OV在神经母细胞瘤治疗中的研究进展，包括其在细胞系、动物模型中的研究及临床试验结果展开系统综述。
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溶瘤病毒（oncolytic viruses，OV）是除传统的手术、化学药物治疗、放射治疗和当前的免疫治疗外，又一新兴的肿瘤疗法。天然及基因改造后的OV可特异性识别肿瘤细胞，具有靶向性好、杀伤率高、不良反应少、能避免耐药性、成本廉价低等优点[1]。OV与化学药物治疗、放射治疗联合使用具有协同作用，能大大提升抗肿瘤效果[2]，尤其是联合免疫治疗。当前，OV研究发展迅速，有望成为肿瘤治疗的新方向。
神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是一种源自神经嵴的神经内分泌肿瘤，其中肾上腺是最常见的原发部位。NB是婴幼儿最常见的恶性肿瘤，也是儿童中最常见的颅外实体瘤。40%在1岁前被确诊，80%~90%在5岁前被发现[3]。NB低危组和中危组患儿治愈率可观，然而高危组患儿的治愈率仅为30%左右，治疗高危NB仍是当前的医学难题；但OV的发现为NB高危患儿带来了新希望。
OV通过引起细胞病理效应和机体免疫反应来发挥抗肿瘤效应。首先，OV可通过溶瘤作用直接裂解肿瘤细胞，释放的子代病毒又能继续感染肿瘤细胞，因而实现溶瘤的级联放大效应。激发机体抗肿瘤免疫被认为是OV发挥作用的另一重要且主要的机制。免疫系统最初被认为是OV发挥作用的一大障碍，但是随着研究进展，人们注意到了免疫系统对于OV发挥作用的正向作用[4]。OV入侵引发机体免疫，尽管有部分OV会被免疫系统消灭，但研究发现NK细胞往往对OV的治疗效果有积极作用[5]，且许多研究表明固有免疫及适应性免疫能增强OV的抗肿瘤效果[4]。被OV裂解的细胞释放可溶性抗原、危险信号及Ⅰ型干扰素，从而导致肿瘤浸润淋巴细胞的类型、数量和激活状态发生改变，驱动抗肿瘤免疫[6]，将免疫抑制的肿瘤微环境转化为免疫刺激状态，使效应T细胞进入肿瘤床并杀死肿瘤细胞。一些被改造的OV还可以表达治疗性基因，通过携带免疫调节因子等方式进一步增强T细胞在免疫排斥性肿瘤微环境中募集[7]。此外，肿瘤内注射OV后，除对局部肿瘤细胞具有杀伤作用外，肿瘤浸润淋巴细胞还会转移到远处未注射部位，产生远端效应[8]。相关研究表明，CD8+和CD4+细胞以IFN I依赖的方式向远端病变处浸润[9]，对具有相似分子结构的远端肿瘤细胞产生影响，从而产生全身性抗肿瘤免疫。
OV较少依赖于特定的受体表达模式以及可能发生的突变或转录抗性，与传统的肿瘤疗法比较，具有精确的靶向性，且避免了化学药物治疗过程中存在的耐药性问题。尽管免疫检查点抑制剂的研发解决了传统放、化学药物治疗中存在的上述问题，但是其导致的肺炎、胰腺炎、结肠炎等严重免疫不良反应时间已经成为其潜在的局限性[10]。溶瘤病毒较高的安全性及多途径杀伤肿瘤的机制，使得其在肿瘤联合用药领域存在很大潜力。相关研究表明，OV联合放射治疗能够显著增强抑制肿瘤生长的效应；OV联合化学药物治疗一方面减轻了其潜在的并发症，另一方面降低了药物的用量，减轻了药物可能带来的不良反应，也降低了机体产生耐药性的可能[6]。OV联合免疫治疗更是具有广阔前景，与抗CTLA-4抗体、抗PD-L1/PD-1抗体等多种免疫检查点抑制剂联合使用往往更加安全和有效[11]。
OV可分为天然溶瘤病毒和经过基因改造的溶瘤病毒两大类。目前用于溶瘤治疗研究的病毒高达数十种，其中常用的野生型病毒株和天然弱毒病毒株有呼肠弧病毒、新城疫病毒和细小病毒等，经基因改造后具有靶向肿瘤细胞特性的有腺病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒等。不同类型的OV都有其各自的优缺点，也分别适用于不同特点肿瘤的治疗。
腺病毒（adenovirus，AD）是目前最常用的病毒载体[12]，是一种无包膜的双链DNA病毒，通过纤毛的头节区粘附于细胞表面的柯萨奇受体（coxsackie-adenovirus receptor, CAR），具有嗜上皮细胞特性。目前发现至少存在70种血清型的人腺病毒，其中血清型5是最常用的[13]。溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus, oAD）是将腺病毒进行基因改造后得到的溶瘤病毒，通过对E1A或E1B或E3基因的改造，使其获得特异的肿瘤细胞嗜性。单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）是一种有包膜的双链DNA病毒，不能与宿主DNA整合，且具有嗜神经性。HSV是一款安全性较高的治疗性病毒载体，经基因改造后可获得特异的肿瘤细胞靶向性和显著杀伤能力，其中研究最多的是HSV-1, HSV-1也是最早被开发成重组溶瘤病毒治疗载体的病毒之一[14]。但是在人群中，普遍存在高血清浓度的HSV中和抗体，这给溶瘤性HSV的全身性分布带来了障碍，因而只能瘤内注射进行局部治疗，应避免静脉给药。此外，常用的OV还有新城疫病毒（neuroblastoma，NDV ）、脊髓灰质炎病毒（poliovirus，PV）以及麻疹病毒（measles virus，MV）等。
有多种OV细胞用于研究NB的治疗，其中研究最多的是oAD和HSV，此外还有新城疫病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒等。AD可通过各种机制被改造成各种oAD，其靶向策略包括敲除AD在正常细胞内复制必需而在肿瘤细胞内非必需的基因、插入肿瘤特异性启动子、改造AD的衣壳、介导靶向药物几大类[15]。HSV具有神经嗜性，安全性高，且由于儿童患儿使用HSV预防药物的比例要低得多，HSV血清阳性率低，对HSV的免疫抵抗弱，所以系统治疗可能更成功[16]。因此HSV在治疗儿童NB方面具有很大优势，其研发策略与AD基本相同。PV在治疗NB上也有研究，但由于脊髓灰质炎病毒具有极强的神经毒性，故将其作为溶瘤载体，首先要减弱其神经毒性。下文将重点阐述溶瘤腺病毒（oAD）、溶瘤性单纯疱疹病毒（oncolytic herpes simplex virus, oHSV）及溶瘤性脊髓灰质炎病毒（oncolytic poliovirus, oPV）在治疗NB方面的最新研究进展。
NB细胞系是将神经母细胞瘤细胞进行体外培养并经过人工纯化后得到的细胞群，是用于研究NB致癌机制的重要且经济有效的模型。NB细胞系可以根据不同遗传病变分为不同的组，例如MYCN拷贝数扩增，ALK激活突变，染色体丢失或增加，TERT重排[17]。不同的细胞系可用于研究不同类型基因在NB发病或治疗中的作用。Harenza等[17]曾对39个常用的神经母细胞瘤细胞系进行RNA测序，提供了其全部的原始转录组数据，为实验者们提供了方便。
利用oAD治疗NB具有无限可能。改造AD的策略之一是直接靶向癌细胞相关基因。MYCN基因扩增是NB的典型特征，MYCN在促进NB细胞生长、抑制其分化和凋亡、促进转移侵袭及促进肿瘤血管生成方面发挥重要作用[18]。Li等[19]曾构建了一种溶瘤腺病毒ZD55-shMYCN，该病毒携带靶向MYCN基因的shRNA。他们用ZD55-shMYCN感染p53-缺失和MYCN扩增的NB细胞系LA1-55N，实验结果表面ZD55-shMYCN具有选择性复制的能力，并明显降低了MYCN癌基因在LA1-55N细胞中的表达。且进一步研究表明，ZD55-shMYCN通过上调RKIP从而诱导NB细胞凋亡[20]。此研究为治疗MYCN扩增的侵袭性NB提供了一种新药物研发方向，为进一步临床研究提供了一种有前景的方法。
除MYCN扩增外，人端粒酶逆转录酶（hTERT）重排导致hTERT激活是NB的另一重要特征，往往导致NB预后不良。Tanimoto等[21]开发出了两种溶瘤腺病毒：OBP-301和OBP-702，以hTERT启动子驱动病毒E1基因的表达，以实现肿瘤特异性病毒复制。并利用MYCN扩增的NB细胞株——IMR-32, CHP-134, NB-1, LA-N-5，证明了其杀伤NB的作用。这些hTERT驱动的oAD有希望通过e2f1介导的MYCN蛋白抑制来消除MYCN扩增，有助于研发抗NB的新型药物。
HSV亦是当前溶瘤病毒治疗NB的研究热点。HSV1716是一种通过敲除RL1而减毒的HSV-1，该基因编码一种被称为"神经毒力因子的"ICP34. 5蛋白[22]。Currier等[22]利用S462TY和SK-N-AS2两个NB细胞系研究发现，小分子Aurora A激酶抑制剂alisertib与HSV1716联合治疗能显著提高抗肿瘤疗效。Li等[23]构建了一种HSV-2溶瘤病毒——FusOn-H2，它通过激活Ras信号通路选择性靶向肿瘤细胞。在Neuro-2A小鼠NB系中的研究证实了FusOn-H2对NB的杀伤作用，并诱导了肿瘤免疫，在根除实体瘤方面有巨大潜力。
最新的研究发现，Sindbis病毒（SINV）是一种很有前途的治疗高危NB的策略。SINV是一种蚊媒甲型病毒，是一种包膜的正链RNA病毒，可导致小鼠神经元感染和年龄依赖性脑脊髓炎，以及人类轻度蚊媒病毒性关节炎。Saito等[24]发现了一种紫外灭活的SINV，其在NB细胞系NB69、NGP和RT-BM-1中比在正常人成纤维细胞中有更显著的细胞毒性，且发现紫外灭活的SINV是通过E1结构蛋白来诱导细胞凋亡的。此发现提供了一种治疗高危NB的新策略，具有研究前景。
建立临床前动物模型是联系实验室研究与临床的重点，常用的人源化小鼠模型有细胞系异体移植模型（cell derived xenograft, CDX）和人源肿瘤异种移植模型（patient-derived tumor xenograft, PDX)。CDX模型主要是将肿瘤细胞系移植到裸鼠或者NSG小鼠体内而构建的肿瘤模型，PDX模型是将来源于患儿的肿瘤组织、原代细胞植入重症免疫缺陷型小鼠（NSG）的体内形成的移植瘤模型。与传统的CDX模型相比，PDX模型能够相对准确地反映原始肿瘤异质性及遗传信息多样性，在临床肿瘤转化研究中具有较大优势[25]。
在上述提到过的溶瘤腺病毒ZD55-shMYCN研发过程中，Li等[19]通过向裸鼠皮下注射LA1-55N细胞建立了小鼠移植瘤模型，当肿瘤达到100~150 mm3时，小鼠被随机分组，瘤内注射ZD55-shMYCN、ZD55-EGFP、Ad-shMYCN或PBS作为对照。实验结果表明，ZD55-shMYCN治疗后的肿瘤体积平均大小为92. 35 mm3，远小于ZD55-EGFP治疗组(820. 69 mm3）和Ad-shMYCN治疗组（713. 65 mm3)，除了抑制NB生长外，甚至使得肿瘤的体积减小。ZD55-shMYCN在体内具有较强的抑制肿瘤生长的作用。
除了AD和HSV，上一部分中提到的PV经改造后在治疗NB方面也有其优势，但是减弱其神经毒性是其应用的前提。Toyoda等[26]通过向5’非翻译基因组区域（mono-crePV）插入1个固有复制元件（cre ）研制出了一种新型稳定的减毒PV，且另一种主范围突变（A133G）赋予了病毒在表达CD155(PV受体）的小鼠NB细胞（Neuro-2aCD155）中复制的能力，该新型OV被命名为A133Gmono-crePV。在建立动物模型时，考虑到生活中绝大部分人有PV先天或后天免疫性这一事实，实验者将脊髓灰质炎病毒易感的免疫活性转基因小鼠（CD155 tg小鼠）与A/J小鼠杂交生成了能够免疫脊髓灰质炎病毒的CD155 tgA/J小鼠，然后将Neuro-2aCD155细胞移植到CD155 tgA/J小鼠体内，制造出了NB小鼠模型。之后将A133Gmono-cre PV瘤内注射，实验结果显示，尽管CD155 tgA/J小鼠体内已有高滴度的抗PV抗体，其体内的Neuro-2aCD155肿瘤通过瘤内注射A133Gmono-cre PV而消除。且实验观察到，若之后重新向被治愈的小鼠体内注射Neuro-2aCD155细胞，不会再观察到NB生长，且后续研究表明A133Gmono-crePV治疗后可诱导小鼠对NB的抗肿瘤免疫，这种免疫是由细胞毒性CD8+ T细胞介导的[27]。此外，后续研究还发现用PV感染的NB细胞裂解液免疫CD155 tgA/J小鼠可使其生存时间显著延长，这为将来治疗免疫原性差的人类肿瘤提供了一种解决方案[27]。该动物模型实验表明A133Gmono-crePV在治疗NB方面是一种有希望的候选OV。
人源化小鼠模型在研究OV治疗NB方面有其巨大优势，但同时也存在局限性：宿主小鼠免疫系统异常、肿瘤异质性。免疫缺陷小鼠缺乏T、B细胞，这些小鼠的免疫抑制状态使得研究组忽略了机体的抗病毒免疫反应以及免疫系统在协助OV治疗方面的作用，也妨碍了免疫治疗试验。目前，研究者们正在尝试通过注射人造血干细胞的方法在小鼠体内重建免疫系统[28]。
此外，由于人MYCN原癌基因拷贝数扩增与NB发生的关系已经得到证实，Weiss等[29]通过酪氨酸羟化酶启动子开发了一种靶向神经嵴发育过程中MYCN表达的TH-MYCN转基因神经母细胞瘤小鼠模型，这避免了以上免疫缺陷小鼠模型的局限性，在研究NB的发展和评价新的靶向肿瘤治疗方面也具有较大优势。Franco-Luzón等[30]利用TH-MYCN转基因神经母细胞瘤小鼠模型对其开发的一种新的转移性肿瘤治疗策略——Celyvir进行了研究。Celyvir是一种携带oAD的间充质干细胞（MSCs），MSCs具有定位肿瘤的能力，趋化细胞因子和整合素参与了干细胞迁移的过程，可靶向颅内肿瘤，且允许腺病毒复制，并可能在静脉输注后的第一个小时内保护溶瘤病毒免于中和抗体和先天免疫反应[31]。他们研究发现，MSCs运输OV至肿瘤区域的效果比静脉注射裸颗粒显著，且MSCs对oAD的保护并不妨碍其发挥杀伤NB的作用，免疫细胞在肿瘤区域的浸润显著增加[30]。且Moreno等[32]发现经血来源的MSCs可以代替骨髓来源的MSCs，且使用异体MSCs进行治疗存在好处，并具体阐明了治疗过程中的免疫机制。此动物模型以及MSCs携带OV靶向NB方式的研发，将进一步推进OV在治疗NB中的研究，是当前的研究热点。
目前已有不少种类的溶瘤病毒进入治疗各种癌症临床试验阶段，对于神经母细胞瘤的临床前及临床中实验也不断在进行。OV联合化学药物治疗、放射治疗及免疫治疗，尤其是与免疫检查点的联合使用，是当前临床研究中治疗NB的有效方式。
化学药物治疗是NB治疗中为数不多的有效手段，但是化学药物治疗多耐药性的出现成为了阻碍NB治疗的主要障碍。上文中提到的溶瘤腺病毒ZD55-shMYCN，经Li等[33]利用LA1-55N细胞系进一步深入研究发现，由于神经母细胞瘤中多耐药性相关蛋白（muti-drug resistance-associated protein, MRP）的表达与MYCN癌基因密切相关，ZD55-sh-MYCN通过下调MYCN降低MRP的表达，使广泛耐药的NB细胞对阿霉素重新敏感，表现为增殖减少、凋亡增加和细胞迁移受到抑制。因此，ZD55-shMYCN联合阿霉素进行化学药物治疗为阿霉素耐药的NB提供了一种新的治疗策略。尽管该研究目前尚未有临床试验的报道，但确实是一个有前景的临床治疗方案。
目前已有溶瘤病毒在NB散发病例中的使用报道，也有一些溶瘤病毒已经进入神经母细胞瘤治疗的临床试验阶段。Pexa-Vec(JX-594）是一种具有溶瘤和免疫治疗作用的牛痘病毒，其肿瘤特异性是由粒细胞-巨噬细胞集群体刺激因子驱动。Pexa-Vec已在成人身上完成了2期试验，2015年时Cripe等[34]测试了Pexa-Vec在2例患有神经母细胞瘤Ⅳ期的儿童患儿身上的治疗效果。在研究观察期间无死亡病例，但会导致短暂的流感样症状和脓疱。试验数据表明适宜剂量的Pexa-Vec瘤内注射对幼童是相对安全的，Pexa-Vec可以在NB患儿群体中进一步研究。NTX-010(senecavalley virus）是一种溶瘤性RNA病毒，已被证明可在表达神经内分泌特征的肿瘤中诱导细胞毒性，其中包括NB[35]。NTX-010在表达神经内分泌特征的成年晚期实体瘤中的I期已经完成，并取得了显著成效。之后Burke等[36]进行了NTX-010在儿童实体瘤中的Ⅰ期试验，结果显示NTX-010单独使用或联合环磷酰胺是可行的。
此外，对于上文中提到的Franco-Luzón等[30]研发的Celyvir（一种携带oAD的MSCs），也已经进入临床试验阶段，展开了Celyvir治疗复发性实体肿瘤的首次对人、对儿童试验。他们招募了15名儿童和19名成人患儿，实验结果显示没有2~5级毒副作用，2个神经母细胞瘤患儿显示疾病稳定，其中1个继续治疗长达6周。该试验说明Celyvir是安全的，值得进行Ⅱ期评估[37]。此外，他们还通过对1例Celyvir治疗难治性神经母细胞瘤临床病例的研究，解释了Celyvir治疗和肿瘤之间的相互作用，以及两者之间的平衡及进化关系[38]。使用间充质干细胞可以增加患儿体内的溶瘤病毒的数量，最大限度地减少毒性，是OV治疗NB研究过程中的一个进步。
OV用于治疗NB的最大挑战之一是机体免疫系统对OV的清除，对于单纯疱疹病毒等常见病毒，人群中普遍存在高血清浓度的中和抗体，且单核细胞和巨噬细胞会吞噬病毒，这使得OV往往在发挥抗肿瘤效应之前即被清除。宿主免疫反应带来的另一个问题是对病毒治疗的过度激活，OV的全身扩散会导致严重的非靶向性感染。这一问题可以通过减弱病毒或抑制相关免疫通路来解决[39]。另一大挑战是缺乏有效的药物输送方式。由于上述免疫清除作用，静脉注射的溶瘤病毒往往被降解减毒，故生物利用度极低[10]。如今OV治疗主要依靠瘤内注射的方式来达到有效的治疗浓度，这使其应用局限于离体表近的、便于手术的癌症类型。在最新研究成果中，上述提及的利用MSCs携带OV解决了目前存在的这两大问题。MSCs在靶向NB的同时保护溶瘤病毒免于中和抗体和先天免疫反应，同时不影响OV的抗肿瘤效果。这一最新研究成果是将OV应用于临床治疗NB的一大进步。此外，目前仍没有针对临床使用OV的制造和表征的具体监管指南，这使OV在临床研究中可能面临伦理和安全方面的问题。而且其治疗效果可能仅在少数患儿中起作用。因此OV用于治疗NB仍有很长的路要走。
总体来看，OV为难以治愈的NB带来了新希望。经基因改造后的各种类型OV在NB细胞系的研究中呈现出良好的治疗效果，但仍需在人源化小鼠模型中进行更贴合原始NB特点的试验，从而更准确地预测其临床效果。目前已经有溶瘤病毒在散发NB病例中试验的报道，也有OV进入了NB治疗的临床试验阶段，其试验结果呈现出良好态势，虽然也可能出现轻微副作用。此外，OV还能对某些化学药物治疗耐药性NB细胞起作用，以提高治疗效果。其与基因治疗、免疫治疗、放射治疗、化学药物治疗等疗法联合使用均有明显效果，有望成为NB的辅助治疗方法。但是OV目前仍面临着一些严峻的挑战，建议进一步的研究可以聚焦建立有效的免疫动物模型，着力解决当前OV面临的上述挑战，寻找有效的药物输送方式，探索使免疫系统对OV作用发挥正向调节的机制。当前，从实验室研究到临床试验，OV治疗NB的效果都十分可观，相信随着研究的进行，溶瘤病毒有望成为神经母细胞的一线治疗方法。
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