随着经导管主动脉瓣置入术的开展，人工生物心脏瓣膜因其具有良好的血流动力学特性和较低的抗凝要求被广泛地应用于老年患者的瓣膜置换上。其最大的缺陷是瓣膜钙化的发生，从而导致瓣膜短期内的衰败，增加了反复手术的概率，影响患者的生存质量和生命周期，严重限制了生物心脏瓣膜的应用范围和应用前景。本综述回顾了近年来发展的抗钙化交联方式与具有抗钙化特性的新型生物瓣膜材料运用，通过优化抗钙化交联方式，调控瓣膜钙化形成的机制或者寻找具有更优质抗钙化特性的新型生物瓣膜材料，寻找解决人工生物心脏瓣膜钙化的出路。
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心脏瓣膜疾病发病率，致死率高，患者年龄跨度大，据统计，全世界每年实施瓣膜置换手术数量达28万例[1,2]。
不同种类瓣膜中，生物瓣膜因良好的体内血流动力学和生物相容性，以及抗凝要求低而被广泛采用。随着经导管主动脉瓣置入术的广泛开展，其需求量也逐年增加。但是，其主要问题在于耐久性不佳，植入体内10~15年后即发生衰败，在患儿中更早发生。衰败的生物瓣膜以钙化为最突出表现。所以，如何限制生物瓣膜的钙化以提高耐久性是未来研究的方向。本研究将就近年来发展的抗钙化交联方式与具有抗钙化特性的新型生物瓣膜材料展开综述。
传统的生物瓣膜钙化是指取材于猪心包及主动脉壁，牛心包及颈静脉并以戊二醛交联固定法制作的生物瓣膜，其表面结构被磷酸钙及钙盐所替代的病理变化。近年来，科学家发现了引起传统生物瓣膜钙化的几个主要原因。
戊二醛交联固定法是引发生物瓣膜钙化的最主要原因。实验表明，生物瓣膜在植入人体后发生的钙化过程主要涉及被动机制，植入物异种细胞及细胞成分的残留以及细胞膜/器相关的磷脂分子与钙离子的成核反应是钙化启动的最主要因素。戊二醛交联虽然利用醛基与瓣膜材料胶原蛋白中的氨基形成Schiff反应，构成碳原子的五元环，稳定胶原蛋白，增加组织抗酶解，减少组织抗原、增加力学性能[3]，但也使生物瓣膜组织中的细胞死亡并残留,破坏膜上钙离子泵。钙离子与磷酸盐物质的接触机会变大，易于形成成核反应[4]。
此外，戊二醛也可以通过影响生物瓣膜组织的其他结构导致钙化[4,5,6]：①有戊二醛醛基残留，可与钙离子直接结合；②无法固定弹性蛋白和糖胺聚糖，降低瓣膜耐久性并促进钙化，金属蛋白酶和组织蛋白酶可促使弹性蛋白降解及促炎肽的形成，诱发钙化沉积；③使氨基酸残基数量减少，胶原的磷酸键暴露，瓣膜表面负电荷增加，与正电荷的钙离子结合；④生物瓣膜不具有人体心脏瓣膜表面的内皮细胞抗钙化屏障，由于血小板及纤维素的黏附及钙磷的渗入导致钙化生成。由此看来，经戊二醛交联从多方面改变生物瓣膜组织细胞结构，是诱发生物瓣膜钙化的根本原因。
生物瓣膜钙化的起始及最严重的部位往往与所受机械应力最大的部位重合，比如瓣膜交界处由于长期剧烈牵拉将导致胶原纤维断裂，提供额外的钙化结合位点[7]。因为人体左心承担机械应力更大，故生物瓣植入到三尖瓣和肺动脉瓣位置较植入到二尖瓣和主动脉瓣位置的发生钙化情况少。左心又以二尖瓣位置所受机械应力更大，更易发生钙化。此外，一些生物瓣膜由于应力设计缺陷以及非生理的支架构造，将造成血流动力学不良，在血液滞留区引发血栓形成，促使钙盐沉积，导致血栓形成，重复钙化循环。
随访表明儿童相较老人生物瓣膜衰败更快速[8]，这意味着代谢水平可能与生物瓣膜钙化有着密切关系。此外，对于钙磷代谢紊乱患者，其体内高钙磷环境更易导致植入物钙化的发生。
戊二醛交联仍会造成部分抗原性残留。异物反应起始于血液中的蛋白吸附到植入物表面，巨噬细胞进一步黏附[9]。巨噬细胞功能多变，可根据免疫细胞发出的信号及植入物材质改变为炎症表型（M1）及抗炎表型（M2）。M2型的CD206+巨噬细胞，是组织修复的效应器，分泌肝细胞生长因子和血管生成因子来调节免疫反应，减少钙化[10,11]。M1型的CD68+巨噬细胞通过上调ROS基因，一氧化氮合酶，TNF-α和IL-12的含量来介导炎症反应，导致钙化[12]。Taraballi等[9]揭示了由周围免疫细胞引发巨噬细胞表型改变的通路：①免疫细胞信号通路；②组织损伤病原体通路；③神经内分泌通路。这三种通路可调动数个受体和分子介导钙化形成。
尽管戊二醛交联的方式从多方面诱发钙化形成。但由于其价格便宜，易于操作，可加强生物组织稳定性，降低免疫原性，提升力学性能和耐久性，故以戊二醛交联为基础的传统生物瓣膜，仍然是目前临床应用的主流产品。近年来，科学家们在戊二醛交联法的基础上，通过修饰提升了其抗钙化特性。
人类心脏瓣膜中主要存在的两种糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）分别是透明质酸和硫酸软骨素。戊二醛交联将导致GAG丢失，而透明质酸作为外源性GAG来源能够补充GAG以增强人工生物心脏瓣膜的稳定性。Lei等[13]在此基础上采用戊二醛/透明质酸/硫酸软骨素和三偏磷酸钠交联猪心包，发现5%浓度的透明质酸和10%浓度的硫酸软骨素对GAG的稳定化效果最好，减少了钙化。
除此之外，Lei等[14]还开发了具有血管内皮生长因子透明质酸水凝胶涂层的猪心包，成功减少了钙化。透明质酸与1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联形成透明质酸水凝胶后，再以其为载体负载血管内皮生长因子，能够增强内皮细胞在心包上的黏附和增殖。当失去内皮细胞时，白细胞将聚集并释放成骨作用的生长因子和细胞因子。平滑肌细胞或免疫细胞的聚集，增殖和迁移过程等均可导致钙化的形成[15]。
透明质酸酶抑制剂以三硫酸新霉素（neomycin trisulfate，NT）最为常用，它通过抑制透明质酸的降解，减少GAG的丢失。Lei等[16]采用3,4-羟苯基丙酸/三硫酸新霉素/辣根过氧化物酶（P-hydroxybenzene propanoic acid/neomycin trisulfate/horseradish peroxidase, HPA/NT/HRP）交联法，增加了植入物GAG稳定性，减少了钙化。实验还证实，植入物在血液暴露中具有较低的免疫原性。
降钙素是一种多肽类激素，其主要作用是通过对骨骼、肾脏和胃肠道的调节降低血钙。Agathos等[17]在大鼠皮下植入了经鲑鱼降钙素抗钙化处理的戊二醛交联的猪主动脉瓣，明显减轻了植入物的钙化。科学家们进一步发现，当降钙素浓度为1%时抗钙化作用更佳[18]。
在此基础上，Agathos等[18]还引入了同为抗钙剂的亚硫酸氢钠去除游离醛，并在37 ℃时加入表面活性剂吐温-80和酒精对戊二醛交联的猪主动脉瓣进一步处理。通过去除赖氨酸侧链与戊二醛之间形成的不稳定的Schiff键以及脂质如胆固醇、游离脂肪酸和磷脂[18]，此类方式取得了良好的抗钙化效果。未来，不同降钙素浓度可以进行深入探究，以选择合适的浓度以达到更好的抗钙化效果。
肝素表面呈现高负电荷。羧基和硫酸根的存在使其能与磷酸钙等生物矿物的阳离子区域形成静电相互作用，是潜在的抗钙剂[19]。此外，肝素本身富含大量GAG，可以补充因戊二醛交联而丢失的部分。
Yang等[20]的实验证明，经过脱细胞化和戊二醛交联的猪心脏瓣膜，通过表面肝素处理减少了钙化。溯其原因，肝素可能通过使游离醛分子失活，形成保护层阻止游离醛释放，减少蛋白质和血小板在组织上的吸附来防止钙化[19]。
肝素水凝胶则是另一种独特的交联方式。水溶性和亲水性的高分子，经过物理或者化学交联都可以形成水凝胶形式，维持一定形状和体积，类似软组织结构。Badria等[19]通过肝素水凝胶包埋增加了戊二醛交联牛心包的抗钙化性能，显著抑制了磷酸八钙的形成速度。
不过，不同水凝胶的使用在抗钙化机制中的作用和效果各有差异。阴离子聚合物海藻酸盐溶液在遇到钙离子时可以形成钙钠离子交联[21]的水凝胶结构，钙离子会因与钠离子等一价阳离子的交换反应而被释放到周围介质中[22]。海藻酸盐涂层修饰的动物心包在处于体外高钙磷溶液和大鼠皮下植入模型的情况下，可通过钙、钠离子的不断交换防止钙沉积在人工生物心脏瓣膜上[21]。故此类涂层在未来可以专门用于交联表面具有大量阴离子的植入材料。
戊二醛交联组织中会残存许多死亡的异体细胞，极易启动被动钙化过程，故可通过阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）清除。Braile-Sternieri等[23]将用戊二醛交联，SDS和2-氨基油酸分别处理的猪主动脉植入绵羊的肺动脉处，3个月后发现SDS组和2-氨基油酸组钙化指数均减少，分别为1.9±4.6、0.3±2.4。Liu等[24]指出了SDS法抗钙化的原因：①去除了膜抗原蛋白主要组织相容性复合体Ⅰ分子和α-Gal；②去除了部分胞质细胞骨架蛋白波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白；③去除残留异体细胞残留DNA；④去除10~55 kDa蛋白的最有效方法；⑤使植入物拥有更好的生物相容性。然而有报道表明，SDS的细胞毒性可以影响瓣膜内皮细胞和间质细胞向内生长，破坏瓣膜的细胞外基质，造成瓣膜不可逆的溶胀，变性和抗张力强度下降[25,26]，还会破坏胶原蛋白三重结构域的稳定性，引发瓣膜衰败[25]。所以，需要谨慎看待SDS法的前景。
戊二醛交联被证实存在诸多引发瓣膜钙化的机制，科学家尝试弥补这种缺陷却屡屡碰壁。近年来，科学家们另辟途径，从新型抗钙化交联方式，新型生物瓣膜材料来源这两个角度尝试，使生物瓣膜材料的抗钙化特性得到了提升。
戊二醛交联无法固定弹性蛋白。有学者指出暴露的弹性蛋白可以引发钙化[27]，因其具有磷灰石矿物质的成核位点。钙化可能通过炎症细胞黏附和随后的基质金属蛋白酶分泌而进一步加强[27]。
多酚类物质对胶原蛋白和弹性蛋白有很好的亲和力，尤以原花青素，姜黄素以及表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）为代表。
实验表明[28]原花青素拥有抗瓣膜细胞外基质钙化的功效。Wang等[27]通过原花青素交联猪主动脉发现其可固定弹性蛋白避免其降解引发钙化，且交联的主动脉弹性蛋白还展现了高孔体积，大孔径和高孔隙率的天然结构，显示出优异的血液相容性、抗血栓和抗炎潜力。这是因为：①原花青素的酚羟基与弹性蛋白的阴离子基团可形成氢键，封闭弹性蛋白中成核位点，阻止钙离子被吸引；②抑制了弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解；③抑制了巨噬细胞等炎性细胞聚集并释放诱导钙化的TNF-α和MMP-12。
姜黄素具有抑制钙化[29]，抗炎症[30]，抗氧化[31]的优点。其含有的酚羟基可以和胶原蛋白中游离氨基和羧基形成氢键来稳定胶原。Liu等[32]进行了大鼠皮下植入姜黄素交联牛心包的实验，在植入后第2周和第4周并未产生明显钙化。此外，其还可通过影响瓣膜间质细胞的成骨细胞分化[33]，帮助内皮细胞扩散增殖，促使牛心包膜表面重新内皮化来减少钙化[32]。
EGCG也有固定弹性蛋白的作用。Lei等[34]开发的HPA/EDC/EGCG交联法，以EDC和NHS为原料，通过碳二亚胺耦联反应将HPA和猪心包进行耦联，再通过EGCG和HRP/过氧化氢酶进行交联。大鼠皮下试验表明，此法极大地降低了钙化率并保留了组织的弹性蛋白含量。
尽管多酚类交联剂前景良好，但多酚与蛋白之间的氢键交联是脆弱且可逆的[34]。相比之下，戊二醛交联后Schiff碱中间体的形成，以及Michael加成反应的化学交联能使植入物对胶原酶产生较持久的抵抗力[35]。所以，未来如何使多酚类物质交联更加稳固是值得探索的研究方向。
碳二亚胺能够活化羧基，促使酰胺和酯的生成。最常使用的是EDC，与NHS合用提升耦联强度。虽然EDC/NHS交联的化学键更加稳定，醛基残留少，但结果表明，单纯EDC/NHS法与戊二醛交联抗钙化效果相似[6]，需要开发更新颖的组合交联剂。
Liu等[36]开发了由藻酸盐-EDC/NHS (Alg组)及氧化藻酸盐-EDC/NHS (Alg-CHO组)组成的非谷氨酰胺醛组合交联试剂。海藻酸盐含有丰富的羧基，可被EDC/NHS活化，与细胞外基质中游离氨基结合[36]。Alg-CHO组中的醛基和羧基也可在EDC/NHS的帮助下与游离氨基形成固体化学交联[36]。小鼠体内钙化试验显示，在第2周，Alg组和Alg-CHO组的钙离子浓度分别为(0.1±0.1) μg/mg和(1.0±0.6) μg/mg，远低于戊二醛组的(21.8±0.1) μg/mg；在第4周，Alg组和Alg-CHO组的钙离子浓度分别为（0.7±0.3）μg/mg和（1.1±1.4）μg/mg，也远低于戊二醛组的（32.6±12.8）μg/mg[36]。此外，其细胞相容性，热力学稳定性及再生能力也更加优秀[36]，是一种新颖的交联方式。
多聚环氧化合物带有多个环氧功能基团,可与氨基，羧基和羟基等功能基团发生反应，提升交联度。它与戊二醛相比对细胞毒性小，但仍可以引起与戊二醛相似的异物反应和钙化[6]。
雷洋等[37]为了解决这一问题，通过环氧化合物修饰碳-碳双键，并利用自由基聚合对碳-碳双键加以连接，实现环氧化合物自由基聚合交联方式。其抗胶原蛋白酶降解能力近似戊二醛；并且由于T细胞和巨噬细胞的低表达，因免疫反应引起的钙化减少[37]。此外，由于交联过程中会生成酯键和醚键，生物瓣膜会变得相对柔软，改善瓣膜所受机械应力，避免不良血流动力学情况发生[37]。
Yang等[38]则采用了3-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMS）来交联生物瓣膜。其机制在于环氧化物3-缩水甘油胺的胺基攻击和硅烷醇缩聚所引起的环氧化物开环过程。实验使用1%，2%和4%三种浓度的GPTMS和戊二醛分别交联猪心包，在大鼠皮下植入30 d后，GPTMS组的钙含量分别为（2.1±0.7）μg/mg，（3.8±1.0）μg/mg，（2.5±0.8）μg/mg，均显著低于戊二醛组（107±9.3）μg/mg，且不同浓度GPTMS交联组间的钙含量差异没有统计学意义[38]。
虽然科学家们提出的新型交联方法很多，但是目前大多处于试验阶段。此外，为了达到抗钙化效果的最大化，交联剂的运用种类更加繁多，制备方式也愈发复杂。多种交联剂应用时是否会相互削弱影响抗钙化性能，是否会相互反应引入促钙化物质是新型交联方式面临的不稳定因素。这些局限性促使一些科学家转变思路，从原材料的角度探索新型生物瓣膜材料的抗钙化潜力。
猪小肠黏膜下层细胞外基质CorMatrix®（small intestinal submucosa-extracellular matrix, SIS-ECM）的主要成分为Ⅰ型胶原、糖胺聚糖、纤连蛋白，层粘连蛋白以及生长因子，能够减少因GAG降解引发的钙化。其还具有独特的"生物诱导"性[39]，主要表现于：①通过M2型巨噬细胞降解细胞外基质支架；②降解过程中血管内皮生长因子，TGF-β及内皮抑素和血管抑素的释放；③宿主内皮细胞及间充质干细胞的浸润；④持续的组织和新生血管形成。其3D结构能够诱导宿主细胞向其内部生长，启动和维持细胞增殖分化。其可吸收性帮助完成宿主细胞对于植入物的替代，减少免疫原性降低钙化[39,40]。故此材料适用于儿童植入瓣膜的开发。
然而，其在人体内结果不如预期理想。Padalino等[41]开展了132例心脏不同部位CorMatrix®植入物手术，38例行瓣膜修复的患者，经中位随访25.2个月后，共有6名因非钙化原因进行了瓣膜再成形。在外植体组织中发现了嗜酸性粒细胞炎性浸润情况，患儿更为明显。Rosario-Quinones等[42]认为这可能是因为猪包含了人所缺乏的α-gal表位，引起了免疫反应。
Woo等[43]研究发现，11个CorMatrix®外植体中发生了邻近组织的炎症浸润，8例重度，2例中度，1例轻度。9例的CorMatrix®外植体发生了降解，但并未发现具有组织活性的胶原蛋白的天然心脏细胞替代植入物的证据，"生物诱导"的可行性存疑。
有科学家指出，"生物诱导"特性，可能与瓣膜解剖状态有关。组织瓣的结构不良（通常发生于半月瓣位置）如瓣膜增生纤维化后，以及经皮球囊扩张后在运用CorMatrix®时可能会导致炎症细胞浸润和新生内膜增厚，而非预期的细胞重塑作用[41]，这是因为不正常的流体力学和生物力学环境无法诱导祖细胞增殖成熟[41]。此外，有研究显示，应用于压力较高的心脏内部位如半月瓣时，相比低压环境如心脏外静脉更易发生并发症[39]，提示其易受高压血流冲击影响。但出人意料的是其在主动脉壁和间隔重建晚期随访中却取得了良好的结果，具体原因并未阐明。
上述结果提示我们仍需通过更多体内植入物标本的病理分析明确植入物的炎症反应机制，模拟人体不同部位血流动力学从而探究不同植入部位并发症的原因。
CardioCel®是一种组织工程牛心包，其运用了ADAPT®的尖端再生组织技术，改造生物瓣膜组织使其接近于人体原生组织结构。Neethling等[44]将CardioCel®（经脱细胞，去脂质，0.05%单体戊二醛交联，解毒操作[45]）和0.6%戊二醛交联的牛心包支架XenoLogiX和PeriGuard，以及染料介导的光氧化支架(PhotoFixTM)植入大鼠皮下进行对比研究。12周后，CardioCel®（0.45±0.12）μg/mg组织显示出与PhotoFixTM (0.44±0.21) μg/mg组织相似的钙水平，远低于PeriGuard（0.85±0.66）μg/mg组织及XenoLogiX（0.57±0.34）μg/mg组织。Bell等[46]的随访显示：CardioCel®在植入人体后24个月随访状况良好，8例再次手术干预原因是继发于肉芽组织形成的狭窄，植入的CardioCel®均无钙化发生。Neethling等[47]长达10年CardioCel®植入后随访显示：25位儿童的10年随访生存率达86.9%，2位儿童死于非移植物事件，1位失访，所有植入物均未见钙化。这证明了CardioCel®是一种具有前景的儿童用生物瓣膜材料。
鱼鳔的组成成分主要为Ⅰ型胶原、糖胺聚糖和弹性蛋白。大鼠皮下试验表明，鱼鳔的纤维直径更规则，纤细，更多宿主细胞可浸润到组织的深处。未进行化学交联的鱼鳔组在体内植入后第2、4周的DNA含量明显高于心包组也印证了这一点[48]。据Liu等[49]的钙离子含量测试数据显示，植入2周时未交联及戊二醛化学交联的牛心包组都与对比的鱼鳔组检测到更多的钙，在植入4周后这个数据进一步维持。
此外，CD206+与CD68+巨噬细胞的含量也可衡量抗钙化能力。据Liu等[49]的实验结果，在各组分别植入4周后，戊二醛交联的牛心包组和鱼鳔组中CD68+细胞的含量都非常少，但后者的CD206+巨噬细胞数明显多于前者。戊二醛交联鱼鳔组中CD206+/CD68+巨噬细胞比例在2周和4周均高于戊二醛交联牛心包组。CD206+作为抗炎型表型，其高表达意味着低钙化。
综上，经过脱细胞及戊二醛化学交联的鱼鳔材料是具有前景的抗钙化材料。但是，常规研究表明，戊二醛化学交联并不能稳定GAG和弹性蛋白所造成的钙化[48]，这与戊二醛化学交联鱼鳔材料中表现出的抗钙化特性存在矛盾。这说明戊二醛交联鱼鳔材料的抗钙化特性可能与鱼鳔自身材质和环境等多方面因素有关。
猪是传统的植入物来源，但人们发现，GGTA1基因编码的α-Gal作为猪组织中的主要异种抗原可以引发人体免疫反应，产生抗体，导致炎症钙化[42]。
近年来，CMAH1基因编码的抗原Neu5Gc[50]以及与β4GalNT2糖基转移酶相关的Sd（a）抗原[51]也陆续在猪心包胶原纤维中被检测到，证实导致了戊二醛交联植入物的钙化[52]。所以，有科学家尝试探究敲除这三种致钙化基因的猪心包的抗钙化特性。实验表明，在GGTA1，CMAH和β4GalNT2三基因敲除（triple knockout，TKO）的猪中，三种抗原的含量几乎检测不到。TKO敲除的猪心包瓣膜植入人体内后也极少与人体内IgM及IgG抗体结合，降低了植入物免疫原性[53]，从而提高了瓣膜耐用性。
这种三基因敲除的方法效果良好，但是CRISPR/Cas9技术基因敲除的成本昂贵，且单纯用于瓣膜取材过于浪费。若将猪体其他器官同时用于移植，尚不清楚是否会对其余器官使用造成影响。此外，猪体内是否还存在其他抗原可引起植入物的免疫反应尚待进一步研究。
组织工程心脏瓣膜的支架材料可分为：①生物支架；②合成支架；③细胞捕获型的聚合物ECM支架。生物支架通常采用脱细胞处理的同种或异种生物瓣膜为支架材料，在体外环境下往支架材料的脱细胞基质中加入种子细胞进行培养。当体外培养成熟后，瓣膜将被重新植入人体生长。因为种子细胞培养的瓣膜能随着儿童的成长而生长，且降低了免疫反应引发的钙化，故在儿童应用中具有前景。
生物支架材料中最常用到的是牛心包，因其保持胶原蛋白的能力可观，人体内血流动力学表现良好，再次手术率低。脱细胞处理后残余物的免疫原性以及脱细胞过程对细胞外基质的破坏常导致植入物衰败[54]。Li等[55]经过多次实验，将牛心包通过FTS法（冻融循环+ 1% Triton X-100+ 0.5%钠脱氧胆酸盐）进行处理。这种处理方式保留了支架材料的细胞外基质结构，令植入物展现良好的生物相容性；组织学证据也表明，经处理的植入物钙化很少。未来，如何匹配适宜种子细胞良好生长的生物支架，以及探索减少钙化的方式，无疑有重要意义。
新型生物瓣膜材料与交联方式在抗钙化特性方面取得了明显进步，能够延长植入物的耐久性，减少患者因短期内瓣膜钙化衰败而进行二次换瓣。同时，针对儿童和成人，选择符合患者需要的材料或交联方法具有重要意义。然而，是否还有其他导致植入瓣膜钙化发生的机制还不清楚，许多抗钙化实验仍停留在体外或动物皮下组织中。植入物的体外加速疲劳试验以及植入动物体内循环系统的实验有待进行，从而进一步考察血流环境下植入瓣膜钙化形成的情况。
所有作者均声明不存在利益冲突
