收集2018年1月至2022年2月武汉儿童医院普外科确诊的NB患儿共30例，男17例，女13例，年龄为（46. 59 ± 22. 77）个月。采用荧光原位杂交法（FISH）法检测的MYCN基因扩增和免疫组织化学法检测肿瘤组织病理MYCN的表达，根据MYCN的表达状况，将NB患儿分为MYCN高表达/低表达组。健康对照组选择30例同期正常体检儿童，男15例，女15例，年龄为（44. 87 ± 23. 64）个月，所选两组研究对象在性别、年龄等基本资料具有可比性，差异无统计学意义（P >0. 05）。NB患儿纳入标准：经病理诊断确诊为NB患儿。排除标准：①服用可能影响患儿免疫功能的药物；②合并其他自身免疫性、感染性及肿瘤性等相关疾病；③患儿入院前进行过放化疗治疗；④患儿信息不全。本实验方案经武汉儿童医院伦理委员会批准（编号：2021R134-E01），所有标本收取前均已签署知情同意书。

NB细胞系SK-N-BE(2)和SH-SY-5Y购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，所有用培养液为含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素双抗的PMI1640完全培养基培养，于37℃，5% CO₂培养箱中传代培养。SK-N-BE(2)细胞是MYCN扩增细胞系，SH-SY-5Y细胞是MYCN非扩增细胞系。

ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司），FACS Canto Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司），RT-6100全自动酶标仪（深圳雷杜公司），Axio Vert. A1倒置荧光显微镜（德国蔡司公司），GelDoc-XR凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。胎牛血清、RPMI1640培养基（美国Hyclone公司），淋巴细胞分离液（天津血液研究所），人NK细胞分离试剂盒（德国Miltenyi Biotec公司），Trizol试剂、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒和Lipofectamine^TM2000转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；ECL发光试剂盒和PVDF膜（美国Millipore公司），免疫组织化学试剂盒（美国Dako公司）；siMYCN （SR321048）, siNC（SR30002），pCMV6-MYCN过表达载体（RC201241），pCMV6对照载体（PS100001）（无锡傲锐东源公司），RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（上海碧云天公司）；乳酸脱氢酶(LDH)杀伤活性试剂盒（美国Promega公司），抗MYCN抗体、GAPDH、HRP标记抗人IgG二抗（英国Abcam公司），抗NKG2A抗体、抗NKG2D抗体、抗MICA抗体、抗MICB抗体、抗ULBP1抗体、抗ULBP2/5/6抗体、抗ULBP3抗体（美国R&D公司），γ-干扰素、颗粒酶B和穿孔素检测ELISA试剂盒（武汉博士德生物公司）。

选取NB患儿病理组织切片，经固定、封闭后，先后加入抗MYCN单抗及HRP标记抗人IgG二抗与靶抗原进行结合，加入DBA进行显色，倒置显微镜观察切片中细胞着色状况判断MYCN表达情况。MYCN定位于细胞核，细胞核呈现棕黄色即为MYCN阳性细胞。

参考朱琳等^[9]实验方法。具体为：使用人淋巴细胞分离液分离健康儿童外周血单个核细胞并计数，按每1×10⁷细胞加入80 μL PBS缓冲液及20 μL抗CD56免疫磁珠，4℃避光孵育15 min，加入1 mL的缓冲液，300转/min离心10 min，弃上清，加入50 μL的缓冲液，混匀并加至MiniMACS磁场中，进行细胞分离，无菌试管收集未结合的阴性细胞，重复3次。取下柱子，加入1 mL的培养液，用柱子上的推注器将要分选的阳性细胞推出，即为CD3^-CD56⁺的NK细胞，流式细胞仪检测分离纯度。

在SK-N-BE(2)/SH-SY-5Y细胞生长至70%~80%时，按照Lipofectamine^TM 2000试剂盒说明书进行转染，分别转染siMYCN/siNC质粒，在转染24 h后更换完全培养基，获得siMYCN NB细胞系和siNC NB对照细胞系。利用MYCN过表达质粒对不同NB细胞进行转染，获得pCMV6-MYCN过表达的NB细胞系和pCMV6空载对照细胞系。经实时荧光定量PCR和免疫印迹对MYCN进行干扰/过表达检测验证后，进行后续实验。

采用Trizol法提取各组细胞的总RNA，逆转录为cDNA，按照实时荧光定量PCR试剂盒的说明进行实时荧光定量PCR反应。MYCN上游引物: 5'-ACCCGGACGAAGAT GACTTC T-3',下游引物: 5'-CAGCTCGTTCTC AAGCAGCAT-3'; GAPDH上游引物:5'-ACAA CTTTGGTATCGTGG AAGG-3',下游引物:5'-GCCATCACGCCACAGTT TC-3'。反应体系的扩增条件如下：95 °C 1 min，60 °C 45 s，72 °C 1 min，循环40次，检测MYCN基因的mRNA表达量，GAPDH为内参，采用2^-△△Ct的方法计算目的基因的相对表达量。

Blot印迹分析取对数期生长的细胞，加入RIPA裂解液，在冰上裂解细胞并提取总蛋白，采用BCA法测定所提取蛋白浓度。以20 μg/孔总蛋白量加入SDS-PAGE进行电泳，经PVDF转膜、5%脱脂奶粉封闭后，加入1∶1 000稀释的一抗，4℃孵育过夜，TBS/T缓冲液洗去多余一抗，加入1∶ 5 000稀释的二抗，室温孵育1 h，TBS/T缓冲液洗去多余二抗，加入ECL发光剂进行条带显色。

取1×10³对数生长期的NB细胞接种于96孔板，加入5×10³磁珠分选新鲜NK细胞，于37℃，5% CO₂条件下完全培养液培养24 h。离心收集上清，按照相关细胞因子ELISA检测试剂盒说明书进行操作，分别检测收集上清中γ-干扰素、颗粒酶B和穿孔素的含量。

参考乳酸脱氢酶(LDH)杀伤活性试剂盒操作说明进行。具体如下：取对数生长期的NB细胞为靶细胞，胰酶消化、800转/min离心5 min并将细胞稀释至2×10⁴/ml，按1×10³/孔接种于96孔板，同时将磁珠分选的新鲜NK细胞（效应细胞）分别按不同效靶比（5∶1，10∶1，20:1）加入各孔，使用无血清的RPMI1640培养液在37℃，5% CO₂条件下培养4 h。离心取50 μL上清加入新96孔空白酶标板中，同时加入等体积的LDH反应液，室温孵育30 min后，加入50 μL终止液终止反应。1 h内酶标仪上检测490 nm处吸光度值（OD₄₉₀）。NK细胞杀伤活性（%）计算参考方法^[10]。效应细胞自然释放组和靶细胞自然释放组分别为效应细胞或靶细胞在无其他干预条件下单独培养，靶细胞最大释放组为10 μL 30% Triton X-100溶液直接加入培养，每组均设3个复孔。NK细胞杀伤活性（%）=（实验组OD平均值-靶细胞自然释放组OD平均值-效应细胞自然释放组OD平均值）/（靶细胞最大释放组OD平均值-靶细胞自然释放组OD平均值）×100%。

取1× 10⁵对数生长期的NB细胞接种于6孔板，加入5× 10⁵磁珠分选新鲜NK细胞，于37℃，5% CO₂条件下培养24 h。离心弃上清，分别加入10 μL PE标记的NKG2A和NKG2D抗体，冰浴孵育30 min，500转/min离心5 min，PBS轻洗后，流式细胞仪检测NK细胞表面NK细胞活化受体的表达状况。

收集对数生长期的NB细胞，PBS轻洗后，离心并计数细胞，分别按每10⁶个细胞分别加入1 μg抗MICA、抗MICB、抗ULBP1、抗ULBP2/5/6、抗ULBP3一抗，冰浴孵育30 min，PBS轻洗后，再加FITC标记的IgG1二抗，冰浴孵育30 min，500转/min离心5 min，PBS洗涤后流式细胞仪进行检测。以同型IgG1抗体为阴性对照，用流式细胞仪分析1×10⁴个细胞中阳性细胞数，计算各配体细胞阳性百分率。