探讨先天性心脏病患儿体外循环术后肠道屏障功能损伤、细菌DNA移位及其与术后发生全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）之间的关系。
收集2018年7月至2019年7月上海交通大学医学院附属儿童医院心胸外科收治的61例先天性心脏病行体外循环手术患儿，其中男29例，女32例；年龄为（744.8±947.8）d，年龄范围为2 d~14岁。按术后是否发生SIRS分为SIRS组及无SIRS组。术前和术后2 h、24 h采集静脉血，利用PCR技术进行细菌DNA检测，同时检测肠道损伤标志物二胺氧化酶及肠型脂肪酸结合蛋白，并观察术后是否发生SIRS。
①所有患儿术前细菌PCR均为阴性，术后2 h（322.4±279.6 copies/μl）、术后24 h（366.6±294.9 copies/μl）细菌DNA拷贝数明显较术前升高，与术前相比差异均有显著性（P<0.001）；②体外循环术后2 h血清二胺氧化酶（148.5±93.2 mIU/ml）、肠型脂肪酸结合蛋白（7.8±7.2 ng/ml）水平较术前明显升高，24 h后开始下降，术后2 h、24 h与术前相比差异有显著性（P=0.012、P=0.0089）；③SIRS组术后24 h二胺氧化酶、肠型脂肪酸结合蛋白水平明显升高，与非SIRS组相比差异有显著性（P=0.0308、P=0.0282）。
体外循环术后早期即可发生肠道细菌DNA移位，先天性心脏病体外循环术后SIRS与肠道细菌DNA移位有相关性。
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肠缺血-再灌注损伤在先天性心脏病体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)术中常见，严重者可引起全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）[1,2]，而肠缺血-再灌注损伤和肠道细菌移位与SIRS的形成及预后关系密切。临床上体外循环术后判断肠黏膜屏障损伤及肠道细菌移位的指标和方法阳性率、敏感性较低。细菌DNA移位情况在胃肠道术后、肝硬化等患儿中有所报道[3]，且细菌DNA移位与患儿术后多项指标关联密切。目前尚无先天性心脏病（congenital heart disease；CHD）患儿体外循环术后关于肠道细菌DNA移位的相关报道。本研究应用外周血二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）及肠型脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，IFABP）判断肠黏膜屏障的完整性，用PCR方法动态检测血中细菌DNA拷贝数来判断肠道细菌DNA移位，探讨体外循环术后肠道屏障功能损伤、肠道细菌移位及其与术后SIRS之间的关系。
收集2018年7月至2019年7月上海交通大学附属医学院儿童医院心胸外科收治的61例CHD行体外循环手术患儿的临床资料。其中简单CHD 46例，复杂CHD15例，其中男29例，女32例；年龄为（744.8±947.8）d，年龄范围为2 d~14岁。术前有严重全身性疾病、器官功能障碍及严重并发症的患儿不列入本研究中。术前准备按照心外科常规手术准备进行。术前2 h、术后2 h、24 h分别在严格无菌条件下抽取静脉血2 ml检测，同时收集患儿的体外循环时间、住院时间，气管插管时间及并发症等相关临床资料。患儿监护人均知情同意，并签署知情同意书，本研究经上海市儿童医院伦理委员会审批通过（2019R062-E02）。
按患儿术后有无SIRS，分为SIRS组及无SIRS组。SIRS成人诊断按1991年美国胸科医师学会和危重病医学会联席会议诊断标准[4]，具备以下2项或2项以上体征可诊断SIRS：①体温>38℃或<36℃；②心率>90次/min；③呼吸频率>20次/min；④PaCO2<32 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；⑤白细胞计数>12.0×109/L或<4.0×109/L或未成熟粒细胞>0.10。2005年，多国专家在2001年发表的国际脓毒症诊断共识基础上，根据各年龄段儿童的生理指标特点，制定了国际儿童脓毒症诊断共识，明确了儿童的全身炎症反应综合征的定义。诊断儿童SIRS时临床表现至少出现下列4项标准中的2项：①中心温度>38.5 ℃或<36 ℃；②心动过速，平均心率大于同年龄组正常值2个标准差以上(外界刺激、慢性药物或疼痛刺激除外)，或不可解释的持续性增快0.5~4 h，或<1岁出现心动过缓，平均心率同年龄组正常值第10百分位以下(无外部迷走神经刺激及先天性心脏病以及使用β受体阻滞剂)，或不可解释的持续性减慢超过0.5 h；③平均呼吸频率大于各年龄组正常值2个标准差以上，或因急性病程需机械通气(神经肌肉疾病及全身麻醉影响因素除外)；④白细胞计数升高或下降(继发于化疗的白细胞减少症除外)，或未成熟的中性粒细胞>10%。成人和儿童主要的不同点在于，若患儿仅心率和呼吸增快不应诊为SIRS，儿童必须有体温或白细胞异常，中心体温必须经直肠、膀胱、口腔或中心导管探针测量，而不能经鼓膜、脚趾或腋窝测量[5]。
临床及动物试验均发现肠道细菌移位最常见的是大肠杆菌（占50%以上），故采用引物设计。靶基因为大肠杆菌特异性的β半乳糖苷酶基因的BG1，BG4，扩增产物长度762 bp;所有细菌共有的16SrRNA基因的高度保守区引物16SrRNA+、16SrRNA-，扩增产物长度462 bp。用细菌基因组DNA提取试剂盒（上海润成生物科技有限公司）提取纯菌及全血DNA，进行PCR扩增，确定细菌DNA拷贝数。
按照试剂生产商所提供酶联免附法(ELISA)检测。试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供，实验操作严格按试剂盒说明书完成。
采用SPSS 14.0及GraphPad Prism 8.0软件进行数据的分析处理及图表制作。各项指标均以
±s表示，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，采用Logistic回归、Spearman进行相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有非常显著的统计学意义。
所有患儿术后均存活，2例患儿术后发生气胸，经保守治疗后好转。SIRS组的监护室时间及术后插管时间较无SIRS组延长，手术时间及体外循环时间有缩短，但差异均无统计学意义（表1）。
SIRS组与无SIRS组相关数据比较
SIRS组与无SIRS组相关数据比较
| 分组 | 例数（例） | 手术时间（min） | 体外循环时间（min） | 监护室时间（d） | 术后插管时间（min） |
|---|---|---|---|---|---|
| SIRS组 | 24 | 166. 9±57. 8 | 65. 3±22. 6 | 6. 4±7. 0 | 1527. 6±1851. 6 |
| 无SIRS组 | 37 | 167. 3±64. 0 | 67. 2±27. 7 | 4. 0±1. 7 | 1349. 4±1838. 4 |
注：SIRS，全身炎症反应综合征
体外循环手术后2 h、手术后24 h检测全血细菌DNA，术前均为阴性，术后2 h（322.4±279.6 copies/μl）、术后24 h（366.6±294.9 copies/μl）细菌DNA拷贝数明显较术前升高，与术前相比差异均有统计学意义（表2）。手术后2 h及24 h细菌DNA拷贝数与住院时间及监护室时间相比无明显相关性。
体外循环术后全血细菌DNA、DAO、IFABP检测结果
体外循环术后全血细菌DNA、DAO、IFABP检测结果
| 阶段 | 大肠杆菌浓度（copies/μl） | DAO（mIU/ml） | IFABP（ng/ml） |
|---|---|---|---|
| 术前 | 5. 9±20. 0 | 120. 8±73. 9 | 4. 0 ±3. 3 |
| 术后2 h | 322. 4±279. 6a | 148. 5±93. 2a | 7. 8 ±7. 2 a |
| 术后24 h | 366. 6±294. 9 a | 98. 5±61. 8 a | 3. 1±2. 01a |
注：DAO，外周血二胺氧化酶；IFABP，肠型脂肪酸结合蛋白；a，与术前结果相比，P<0.05
体外循环术后2 h血清DAO水平（148.5±93.2 mIU/ml）立即升高，24 h后（98.5±61.8 mIU/ml）开始下降，术前与术后2 h和24 h相比差异有统计学意义（表2），体外循环术后2 h血清IFABP水平（7.8±7.2 ng/ml）立即升高，24 h（3.1±2.1 ng/ml）开始下降，术前和术后2 h、24 h相比差异有统计学意义（表2）。SIRS组术后24 hDAO、IFABP水平明显升高，与非SIRS组相比差异有统计学意义（P=0.0308、P=0.0282）。
术后24 h血清IFABP水平与术后外周血白细胞呈正相关（P=0.0011，r=0.4）。血清DAO水平变化与白细胞水平未见明显相关性（图1）。
细菌移位（bacterial translocation，BT），又称微生物移位（microbial translocation，MT），是指活的微生物或其产物（包括细菌DNA）从胃肠道穿过黏膜屏障到达肠外部位，通常是无菌组织，例如肠系膜淋巴结，其他内部器官或循环血液系统[6,7]。细菌移位经典的诊断标准要求肠系膜淋巴结细菌培养阳性，但获得肠系膜淋巴结需外科侵入性操作，这在临床上是难以实现的，而且由于抗生素的应用，培养阳性率并不高。1996年Kane等[8]将PCR技术应用于临床患儿细菌DNA检测中，开创了肠道细菌移位研究的新局面。细菌DNA在血液中存在是细菌移位的一个重要标志[9,10]。16SrDNA扩增或测序技术在感染性心内膜炎患儿治疗情况监测以及肝硬化患儿腹水微生物检测等多个方面有广泛应用[3]。
经过体外循环手术的患儿，肠道发生缺血-再灌注损伤，导致肠道黏膜屏障受损，从而引起肠道细菌DNA移位，理论上只要血中存在少量的细菌DNA，应用PCR技术都可将其检测出来。既往部分细菌DNA移位研究中采用凝胶电泳方法检测是否存在细菌移位，但检测时容易受到细菌污染，且易出现主观误差。本研究采用实时定量PCR技术检测患儿静脉血中的细菌DNA拷贝数，以确定患儿术后是否发生细菌DNA移位。从结果来看，患儿手术前检测均为阴性，术后2 h全血中细菌DNA有明显上升，且与术前相比差异有非常显著的统计学意义（P<0.001）。本研究发现体外循环术后早期（2 h）即可发生肠道细菌DNA的移位。本研究检测细菌DNA拷贝数，增加数据的量化性，为之后细菌移位的研究提供了新的研究思路。
Wen等[11]研究者报道了利用PCR手段检测急性胰腺炎患儿血液中的细菌DNA，确定患儿细菌移位的情况，同时发现了急性胰腺炎中肠上皮自噬可能减少肠道细菌移位的发生，其机制可能是通过增强肠上皮T-J蛋白的表达，改变肠道的渗透性，维持肠黏膜的屏障作用。但关于肠道细菌移位的发生机制目前尚无明确的定论，不同疾病导致肠道细菌移位的机制是否不同，仍需要更进一步的研究。同时，本次实验结果中观察到无论是SIRS组或无SIRS组，手术后2 h及24 h细菌DNA拷贝数与住院时间及监护室时间相比无明显相关性（P>0.05），提示体外循环术后细菌DNA移位并不会延长患儿的住院时间和监护室时间，可能因为部分患儿术后发生了细菌DNA移位但及时采取抗生素治疗措施，未进展为较严重的脓毒血症等并发症。
DAO是人类和哺乳动物小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，其活性与黏膜细胞的核酸和蛋白质合成密切相关。当肠黏膜受损后，该酶释放入血导致血清中DAO活性增高，所以其血清水平可以特异性地反应肠壁组织结构的完整性，提示肠道屏障的完整性和受损程度[12,13]。IFABP是一种独特存在于肠上皮细胞的胞浆酶，在脂肪酸的细胞摄取和代谢中起作用[14,15,16]。它存在于小肠绒毛的成熟肠细胞中，一旦细胞膜完整性受损就会释放，随后出现在肠细胞损伤后的循环中[17]。有研究指出IFABP在肠缺血15 min后外周血中即可检出，并持续升高，其作为新生儿坏死性小肠结肠炎的肠道损伤标志物的研究较多[18,19]。Kanda等[20]对小肠缺血性疾病（包括机械性肠梗阻、嵌顿疝、肠系膜梗阻等）的多中心、双盲研究发现血清IFABP是鉴别急腹症中有无小肠缺血发生的有效指标，其特异性为73.8%，灵敏度为78.8%。本研究中，体外循环术后2 h血清中DAO、IFABP水平明显升高，提示体外循环术后早期即可发生肠屏障损伤。
SIRS的诊断标准中包括体温、心率、呼吸频率、PaCO2、白细胞计数等。本研究中，因年龄跨度较大（2 d~14岁），故SIRS的诊断更为严格，必须首先有体温的异常和白细胞计数的异常才能确定该诊断。SIRS组体外循环术后血清DAO和IFABP水平均较无SIRS组高，两者相比差异有统计学意义（P<0.01），由此可见肠道细菌DNA移位与术后SIRS的发生关系密切。除此之外，术后24 h血清IFABP水平与术后外周血白细胞呈正相关（P=0.0011，r=0.4），提示体外循环术后的肠屏障损伤可能会加重机体的炎症反应，但仍需结合其他炎症指标，如内毒素、白细胞介素6、白细胞介素8等炎症因子来确认。
综上所述，体外循环术后发生SIRS的患儿多存在肠道细菌DNA的移位，肠道细菌DNA移位与SIRS的发生可能存在相关性，为临床诊断细菌移位提供了新思路。同时，如果能够探寻出诊断临床显性感染更准确的指标，并指导临床抗生素的使用将会有更大的意义。
所有作者均声明不存在利益冲突
