研究纤维连接蛋白1(fibronectin 1，FN1)在胆道闭锁(biliary atresia，BA)肝纤维化进程中的作用，阐述其作用机制与调控细胞凋亡肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相关因子的关系。
利用基因数据库数据对FN1在肝纤维化中的作用进行生物信息学分析。收集2017年4月至2020年10月在天津市儿童医院普外科手术时留取的患儿肝组织标本31例，其中因非肝胆疾病导致死亡的婴儿肝脏组织样本3例、先天性胆总管扩张症(congenital biliary dilatation，CBD)5例和BA 23例；根据日本Ohkuma's肝纤维化分级标准对所有肝组织样本进行分级处理，按照纤维化程度又将BA分两组：轻度(Ⅰ~Ⅱ级)、重度(Ⅲ~Ⅳ级)；应用免疫组织化学检测FN1、PI3K、p-Akt和肝星状细胞活化标志物α-SMA在肝组织中的表达情况。分析以上蛋白与肝纤维化分级的相关性，利用qRT-PCR检测肝组织FN1 mRNA的表达水平并进行统计学分析。
生物信息分析结果显示FN1在肝脏中表达量较高，是调控小鼠肝纤维化的核心基因之一。FN1在BA肝组织中的表达情况：(1)免疫组织化学检测显示，FN1表达于BA肝细胞的细胞质以及肝细胞外间隙，半定量分析结果显示，FN1的表达水平与肝纤维化程度呈正相关(rs＝0.938，P<0.01)，其在BA重度肝纤维化组表达明显高于轻度肝纤维化组[(0.135 8±0.041 6)比(0.054 8±0.009 5)，t＝－6.035，P<0.001]；(2)qRT-PCR定量分析显示BA重度肝纤维化组FN1 mRNA的表达水平亦显著高于轻度肝纤维化组，为(1.038±0.264 3)ng/ml比(0.522 1±0.236 5)ng/ml，P<0.01。采用Pearson相关分析显示，PI3K与PI3K/Akt通路上下游基因FN1(r＝0.981，P<0.01)和α-SMA(r＝0.988，P<0.01)在BA肝纤维化中的表达都呈现显著正相关；同样，p-Akt与该通路上下游基因FN1(r＝0.946，P<0.01)和α-SMA(r＝0.971，P<0.01)在BA肝纤维化中的表达也都呈现显著正相关。
BA肝组织中FN1随着肝纤维化程度的加重而增加，并经PI3K/Akt信号途径参与调控肝纤维化进程，干预FN1可能会成为治疗BA肝纤维化的新靶点。
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胆道闭锁(biliary atresia，BA)以肝内外胆管进行性炎性阻塞和肝纤维化为特征，是引起婴幼儿梗阻性黄疸的常见原因之一[1]。Kasai手术能够改善BA患儿胆汁引流，延长患儿自体肝生存时间，但远期自体肝生存情况仍不理想，最终需要肝移植来挽救生命[2,3]。及时有效遏制肝纤维化是延长或实现BA患儿长期自体肝生存的关键。
纤维连接蛋白1(fibronectin 1，FN1)是一种多功能细胞外基质(extracellular matrix，ECM)糖蛋白，参与细胞黏附、迁移、增殖和分化，其异常表达与伤口愈合、组织器官纤维化、肿瘤转移等密切相关[4,5]。近年来对于FN1在肝纤维化中的作用机制研究多关注于其作为ECM成分在间质中被动沉积方面，鲜有报道其能够主动参与肝纤维化的发展进程，在BA中的机制研究则更少[6,7,8]。新近的研究报道，经PI3K/Akt途径抑制FN1的表达，能够抑制肝癌细胞的增殖和迁移[9]。FN1是否并如何从PI3K/Akt途径调节BA肝纤维化期间肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的转分化有待研究。因此，FN1对BA肝星状细胞的影响进而调控肝纤维化成为本研究的重点。本研究利用生物信息学分析并通过检测FN1在BA肝纤维化进程中的表达规律，进一步探索其在BA肝纤维化中的作用及临床应用价值。
选取2017年4月至2020年10月在天津市儿童医院普外科手术时留取的患儿肝组织标本31例，其中因非肝胆疾病导致死亡的婴儿肝脏组织样本3例、先天性胆总管扩张症(congenital biliary dilatation，CBD)5例和BA行Kasai手术患儿23例，将BA患儿组织样本作为BA组，非肝胆疾病死亡的婴儿及CBD患儿肝组织样本分别作为正常对照组和疾病对照组(CBD组)。HE染色确定BA分级，根据日本Ohkuma's肝纤维化分级标准对所有肝组织样本进行分级处理，按照纤维化程度又将BA分为两组：轻度纤维化组(Ⅰ~Ⅱ级)、重度纤维化组(Ⅲ~Ⅳ级)。
本研究肝组织样本纳入标准：①正常对照组，因非肝脏疾病导致死亡的婴儿，死亡时年龄<6个月；②CBD组，明确诊断为胆总管扩张症且行肝管空肠吻合术，未合并其他系统畸形；③BA组，术中胆道造影结果及病理检查确诊均为胆道闭锁，未合并其他系统畸形。本研究肝组织样本排除标准：①患儿术前合并有严重的其他系统疾病或严重感染性疾病；②患儿因肝胆系统疾病导致死亡；③资料不完善的患儿；④肝组织样本较小或组织被破坏不适于实验的样本。
本实验研究经天津市儿童医院伦理委员会审查通过(伦理批件号2021-YKY-01)，纳入研究的所有患儿家长均签署知情同意书。
FN1抗体(上海生工生物工程股份有限公司)；PI3K抗体、p-Akt抗体、α-SMA抗体、HRP通用型二抗、封闭用羊血清及DAB试剂(北京博奥森生物技术有限公司)；cDNA合成试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；SYB Green(北京全式金生物技术有限公司)。
基因表达数据来源于人类基因组数据库(HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC)HGNC3778和基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)的肝纤维化相关GSE11954数据集(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。分别分析HGNC3778和GSE11954数据集，以确定编码基因FN1的组织特异性及其在小鼠肝纤维化肝组织中差异表达。
在天津市儿童医院病理科样本库中取出正常肝组织、CBD组及BA组患儿的HE病理切片，由经验丰富的病理科医生在光学显微镜下参考日本Ohkuma's分级标准[10,11]判断肝组织的纤维化程度，无纤维化为0级，肝门管区轻度纤维化为Ⅰ级，伸向临近门管区轻度桥接纤维化为Ⅱ级，伸向临近门管区中度桥接纤维化为Ⅲ级，肝硬化、假小叶形成为Ⅳ级。
术中获取各组患儿肝右叶前缘为活检标本，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋储存，将已包埋肝脏蜡块连续切成4 μm厚切片，烤片90 min，切片脱蜡后置于pH6.0的枸橼酸缓冲液中，微波炉高温加热15 min进行抗原修复，自然冷却至室温，用pH7.3的磷酸盐缓冲液冲洗3次，5 min/次，封闭抗原30 min，甩干后加一抗：FN1(1∶50)、PI3K(1∶150)、p-Akt(1∶100)、α-SMA(1∶100)，置于4℃冰箱孵育过夜，次日取出切片恢复室温，再次用磷酸盐缓冲液冲洗，滴加辣根过氧化物酶二抗结合30 min，磷酸盐缓冲液冲洗后显微镜下观察显色，苏木素染核，固定后透明封片。
①定性分析：根据染色强度分为无棕黄色、淡棕黄色、棕黄色、棕褐色；②半定量分析：每张切片于阳性部位处取5个不同视野100倍显微镜下图片，IPP 6.0图像分析软件分析图片计算FN1、PI3K、p-Akt、α-SMA等蛋白平均光密度值(averageoptical density，AOD)，AOD＝每处视野肝组织阳性细胞光密度总和/阳性面积。
选取样本库中总RNA样本，用cDNA合成试剂盒合成cDNA，用SYB Green在罗氏480实时荧光定量PCR仪上进行PCR，得出CT值，用于检测FN1 mRNA。实验所用引物名称为FN1，上游序列为ACAACACCGAGGTGACTGAGAC，下游序列为GGACACAACGATGCTTCCTGAG。
所有数据采用SPSS 22.0进行统计学分析。对于计量资料先进行正态性检验，如服从正态分布用
±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析。非正态分布计量资料采用中位数及四分位数[M(Q1，Q3)]表示，则进行Mann-Whitney U检验，多重比较采用LSD法。相关性分析采用Pearson相关或Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
HGNC分析结果显示编码基因FN1在肝脏中表达量较高(图1A)。数据集GSE11954运用DNA损伤剂P53致使活化的HSCs衰老，筛选出1598个差异表达基因，其中有703个下调基因(包含FN1)；构建调控肝纤维化的差异表达基因蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，发现FN1是调控肝纤维化的前10核心基因之一(图1B~D)。KEGG通路数据库(https：//www.kegg.jp/kegg-bin/highlight_pathway？scale＝1.0&map＝map04151&keyword＝FN1)显示FN1经PI3K/Akt信号途径调控细胞的衰老凋亡(图2)；对GSE11954数据集进行KEGG通路分析，显示FN1可能经PI3K/Akt信号通路调节了P53对HSCs的衰老功能，从而调控肝纤维化(图3，图4，图5，图6)。本研究推测目的基因FN1可能通过PI3K/Akt信号途径参与了肝纤维化进程。
正常对照组(尸肝组织)3例均为0级；5例CBD中3例为0级，2例为I级；BA组包括：Ⅰ级7例、Ⅱ级6例、Ⅲ级6例、Ⅳ级4例。BA纤维化分组：轻度纤维化组13例，重度纤维化组10例。
如图7所示，FN1主要定位于肝细胞胞质，在对照组显示弱阳性表达，与BA早期的染色有一定相似性；与对照组对比，BA组肝细胞、细胞外间隙和汇管区的FN1染色明显增强，其中Ⅲ、Ⅳ级中FN1阳性肝细胞数量较Ⅰ、Ⅱ级显著增多。半定量分析结果显示：与对照组相比，BA组肝组织中FN1表达明显增高；将FN1的表达与纤维化程度进行Spearman相关分析，发现FN1在肝细胞中的表达与肝纤维化程度呈正相关，rs＝0.938，P<0.01，即随着肝纤维化程度的加重FN1表达逐渐增加，其在BA重度肝纤维化组表达明显高于轻度肝纤维化组，为(0.135 8±0.041 6)比(0.054 8±0.009 5)，t＝－6.035，P<0.001(图8)。
注：CBD，先天性胆管扩张症；BA，胆道闭锁；BA轻度纤维化组(Ⅰ~Ⅱ级)；BA重度纤维化组(Ⅲ~Ⅳ级)；虚线左侧，对照组和BA组间对比；虚线右侧，对照组和BA轻重纤维化组间对比；ns，差异无统计学意义；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
如图9，图10，图11，图12,图13，图14所示，PI3K和p-Akt定位于肝细胞胞质中，在对照组肝组织中的表达量较少，主要在汇管区少量分布，BA组的PI3K和p-Akt阳性表达染色程度及范围随着纤维化程度的加重而增加；α-SMA在对照组肝组织中表达较低，呈弱阳性表达，主要表达在血管壁，在BA肝组织中呈阳性表达，主要分布在肝窦区，亦随着纤维化程度加重而表达增强。半定量分析结果显示：对3组PI3K、p-Akt、α-SMA的AOD值数据资料分析均为偏态分布(表1)，在BA重度肝纤维化组表达明显高于轻度肝纤维化组。
注：CBD，先天性胆管扩张症；BA，胆道闭锁；BA轻度纤维化组(Ⅰ~Ⅱ级)；BA重度纤维化组(Ⅲ~Ⅳ级)；虚线左侧，对照组和BA组间对比；虚线右侧，对照组和BA轻重纤维化组间对比；ns，差异无统计学意义；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
注：CBD，先天性胆管扩张症；BA，胆道闭锁；BA轻度纤维化组(Ⅰ~Ⅱ级)；BA重度纤维化组(Ⅲ~Ⅳ级)；虚线左侧，对照组和BA组间对比；虚线右侧，对照组和BA轻重纤维化组间对比；ns，差异无统计学意义；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
注：CBD，先天性胆管扩张症；BA，胆道闭锁；BA轻度纤维化组(Ⅰ~Ⅱ级)；BA重度纤维化组(Ⅲ~Ⅳ级)；虚线左侧，对照组和BA组间对比；虚线右侧，对照组和BA轻重纤维化组间对比；ns，差异无统计学意义；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
免疫组织化学检测下FN1等抗体的表达情况
免疫组织化学检测下FN1等抗体的表达情况
| 组别 | 例数 | AODFN1[M(Q1，Q3)] | AODPI3K[M(Q1，Q3)] | AODp-Akt[M(Q1，Q3)] | AODα-SMA[M(Q1，Q3)] |
|---|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 3 | 0.0393(0.0366，0.0397)a | 0.0406(0.0403，0.0427)a | 0.0360(0.0301，0.0447)a | 0.0340(0.0258，0.0357)a |
| CBD组 | 5 | 0.0431(0.0408，0.0457)b | 0.0453(0.0441，0.0469)b | 0.0469(0.0451，0.0480)b | 0.0434(0.0427，0.0458)b |
| BA组 | 23 | 0.0685(0.0515，0.1293)c | 0.0717(0.0637，0.1263)c | 0.0679(0.0536，0.1142)c | 0.0653(0.0566，0.1296)c |
| P值 | - | 0.0053c，a，0.0114c，b | 0.0038c，a，0.0054c，b | 0.0046c，a，0.0047c，b | 0.0038c，a，0.0054c，b |
注：CBD，先天性胆管扩张症；BA，胆道闭锁；AOD，平均光密度；c，a、c，b分别是四种抗体BA组与正常对照组和CBD组对比，P值均<0.01；"－"表示没描述
采用Pearson相关分析，分析了PI3K/Akt通路元件PI3K、p-Akt与其上下游基因FN1和α-SMA的关系，结果如下表2所示。PI3K、p-Akt与FN1和α-SMA在BA肝纤维化中的表达都是显著正相关，相关系数分别是0.981、0.988和0.946、0.971。
PI3K/Akt信号通路上游基因纤维连接蛋白1与通路中其他相关基因的相关性分析
PI3K/Akt信号通路上游基因纤维连接蛋白1与通路中其他相关基因的相关性分析
| 相关因素 |  ±s | AODFN1 | AODα-SMA |
|---|---|---|---|
| AODPI3K | 0.1021±0.0496 | 0.981a | 0.988a |
| AODp-Akt | 0.0927±0.0514 | 0.946a | 0.971a |
注：a，置信度(双测)为0.01时，相关性是显著的
结果显示，3组FN1 mRNA数据资料均为正态分布，BA重度肝纤维化组FN1 mRNA的表达显著高于轻度肝纤维化组和CBD组，分别为(1.038±0.264 3)ng/ml比(0.522 1±0.236 5)ng/ml(P<0.01)和(1.038±0.264 3)ng/ml比(0.396 2±0.485 6)ng/ml，(P<0.01)，差异具有统计学意义。
BA是婴儿最常见的胆道梗阻性疾病，也是导致儿童终末期肝硬化的主要原因，发病率为1/18 000~1/8 000[12]。BA的肝纤维化比其他婴儿胆汁淤积性疾病更早、更严重，因此肝纤维化可能是BA病理机制中的主要致病因素，而不是单纯胆汁淤积继发的胆汁性肝硬化[13,14]。
BA肝纤维化形成和发展的中心环节是HSCs增殖活化[15,16]。整个肝纤维化过程受HSC-ECM-HSC反馈环调节，在肝纤维化过程中FN1不仅作为细胞外基质成分在肝内沉积，它还主动参与肝纤维化进程，FN1大量积聚经多种信号途径刺激未激活转化的HSCs转变为肌成纤维细胞，进而促进纤维化的发展[17,18]。
ECM由4种主要蛋白质组成：胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白[19,20]。糖蛋白主要作为细胞外基质中的连接物，介导细胞与细胞外基质、细胞外基质与细胞外基质和细胞外基质可溶性因子间的连接。细胞外基质中有2种主要的糖蛋白：层粘连蛋白和FN1，层粘连蛋白仅局限于基底膜，而FN1广泛存在于间质和基底膜ECM的高度组织化结构中，是组织发育和伤口愈合过程中最早产生的细胞外基质蛋白[21,22]。
FN1在肝脏中主要由肝细胞、HSCs、肌成纤维细胞和血管内皮细胞等合成与分泌，存在于细胞膜、细胞质及细胞外间隙中，肝损伤后FN1不仅在肝内被动沉积，还可与细胞膜上的跨膜受体整合素受体结合，在多种信号通路的调控下调节细胞黏附、迁移、增殖，在纤维化的发生和发展过程中起到重要的作用[23,24,25]。本研究对GSE11954数据集的基因谱进行生物信息学分析，发现FN1是调控肝纤维化的前10核心基因之一。免疫组织化学半定量和定量分析结果可见，不同病因肝受损下肝细胞中FN1的表达均可升高，在BA肝组织中表达尤为显著，其在BA重度纤维化组中的表达量显著高于轻度纤维化组，且FN1的表达水平与肝纤维化程度呈正相关。研究证实，FN1有促进心肌、肺、肾脏等组织器官纤维化的作用[26,27]。结合本团队前期的研究结果可推测FN1参与了BA肝纤维化进程。
KEGG通路数据库查询结果显示，FN1经PI3K/Akt信号途径调控细胞的衰老凋亡。PI3K/Akt通路是调控细胞增殖和衰老凋亡的重要通路[28]。Akt是PI3K的重要靶点，活化的Akt激活或抑制其下游靶蛋白，以调节HSCs增殖和凋亡[29]。对数据集进行KEGG通路分析，显示FN1可能经PI3K/Akt信号通路调节了P53对HSCs的衰老功能，从而调控肝纤维化。此外，对BA肝组织标本进行免疫组织化学检测，半定量分析结果证实PI3K、p-Akt与FN1和α-SMA在BA肝纤维化中的表达都是显著正相关。研究证明FN1通过PI3K/Akt通路能够促进软骨细胞分化和胶原蛋白生成，经PI3K/Akt途径抑制FN1的表达能抑制肝癌细胞的增殖和迁移[9,30]。结合生信分析及前期实验结果，本研究推测FN1可能通过PI3K/Akt信号途径参与调控BA肝纤维化中HSCs的活性，具体机制有待进一步研究验证。
综上所述，GSE11954数据集确定了FN1在肝纤维化中有重要的调控作用；FN1随着BA肝纤维化程度的加重而表达增加；基于现有研究结果，推测BA中FN1高表达可能源于FN1使PI3K/Akt信号通路激活促进了肝纤维化进程。BA肝纤维化是多因素共同作用的结果，其形成机制较为复杂，本团队后期将尝试体外细胞培养以及动物体内实验，通过干预FN1及其通路实验进一步验证其作为延缓BA肝纤维化靶点的效果，进而探究其潜在的临床价值。
所有作者均声明不存在利益冲突
