明确脾血管结扎术与脾切除术对脾脏功能的影响。
将32只6~8周龄雄性SD大鼠按随机数字表法平均分为4组：正常组、对照组、脾血管结扎组和脾切除组。正常组不做任何操作；对照组仅进行开腹操作；脾血管结扎组采用结扎大部分脾动静脉血管的方法进行模型制作；脾切除组采用脾切除的方法进行模型制作。记录手术时间、失血量、胃肠道功能恢复时间(首次进食时间)。收集正常组和术后1个月时对照组、脾血管结扎组和脾切除组的血液样本，用于脾功能的检测(机体免疫功能、脾清除功能和抗感染能力)。采用流式细胞术检测细胞免疫水平(CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞所占比例，并统计CD4+T/CD8+T细胞计数比值)和酶联免疫吸附试验检测体液免疫水平[血清免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G、IgA和IgM水平、外周血白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-6、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平]评价机体免疫功能。采用示差显微镜计数痘痕红细胞出现率评价脾的清除功能。采用内毒素试剂盒检测内毒素水平评价脾的抗感染能力。采用血常规检测红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白计数。两组间比较采用t检验，不同组间两两比较采用One-way ANOVA检验。
正常组和对照组间脾功能(机体免疫功能、脾清除功能和抗感染能力)差异无统计学意义(均P>0.05)。脾切除组比脾血管结扎组的手术时间[(37.5±6.0)min比(22.5±6.0)min，P<0.001]、手术失血量[(1.7±0.5)ml比(0.9±0.5)ml，P＝0.011]、胃肠道功能恢复时间[(6.6±0.9)d比(5.1±1.0)d，P＝0.007]显著增加。与正常组和对照组相比，脾血管结扎组和脾切除组中IgG、IgA和IgM水平、CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞比例显著降低(均P<0.001)；外周血IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和TGF-β1水平、内毒素含量、痘痕红细胞出现率和红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白水平均显著增加(均P<0.001)。脾血管结扎组的IgG、IgA、IgM、IL-2、TGF-β1、CD3+T、CD4+T、CD8+T水平和CD4+T/CD8+T细胞计数比值显著高于脾切除组(均P<0.001)；而其IL-6、TNF-α、内毒素水平、痘痕红细胞出现率、白细胞、血小板和血红蛋白水平显著低于脾切除组(均P<0.001)。
脾血管结扎术和脾切除术显著降低了脾的免疫功能、脾清除能力和抗感染能力；但脾血管结扎术在降低脾功能方面明显弱于脾切除术。因此，脾血管结扎术具有保留部分脾功能的作用。
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脾大和脾功能亢进并非是一种单一疾病，而是由多种原因引起的综合征，临床表现为脾肿大，一种或者多种血细胞减少，而骨髓造血细胞相应增生，脾切除后症状可减轻。但儿童脾切除术后免疫功能降低，导致败血症、爆发性感染和门静脉血栓等风险增加。因此，保留脾的手术(包括脾动脉栓塞术和部分脾切除术)被认为应是治疗儿童脾大的重要方法，但其操作难度大、并发症发生率高、术后易复发，导致临床上对其选择褒贬不一。为此，本组提出腹腔镜脾血管结扎术治疗儿童脾大和脾功能亢进，并获得初步成功，该术式操作简单、创伤小、出血风险低[1,2]。尽管脾血管结扎术在改善脾功能亢进的基础上能够保留部分脾血运，但其能否保留脾的功能(包括免疫功能、脾清除功能和抗感染能力)，迄今未见相关报道。为此，本研究通过动物实验对比脾切除术与脾血管结扎术后的脾功能差异，明确脾血管结扎术保留部分脾的作用及其对脾功能的影响。
将32只SPF级6~8周龄雄性SD大鼠[上海杰思捷实验动物有限公司，SCXK(沪)2018-0004]按随机数字表法平均分为4组(每组8只)：正常组、对照组、脾血管结扎组和脾切除组。正常组不进行任何操作；对照组仅进行开腹操作；脾血管结扎组采用结扎大部分脾动静脉分支血管的方法制作动物模型，该方法与本组既往报道的腹腔镜脾血管结扎术相似[1,2]，在脾门处游离脾动脉和脾静脉，使用丝线结扎大部分动静脉(图1)，胃脾韧带保持完整，以便保留部分脾的血运；脾切除组采用脾切除的方法制作动物模型。本研究获得首都儿科研究所伦理委员会的批准，所有实验设计和研究操作符合《赫尔辛基宣言》。
记录脾血管结扎组和脾切除组的手术时间、术中出血量和术后首次进食时间(评估胃肠功能恢复情况)。收集正常组和术后1个月(以明确手术操作对脾功能的影响)的对照组、脾血管结扎组和脾切除组血液样本，用于免疫功能、脾清除功能和抗感染能力检测。
采用流式细胞术检测细胞免疫水平(CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞所占比例，并统计CD4+T/CD8+T细胞计数比值)。酶联免疫吸附试验检测体液免疫水平[血清免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G、IgA和IgM水平、外周血白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-6、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平]。
在示差显微镜下观察血液中2 000个红细胞，计算痘痕红细胞(示差显微镜下痘痕红细胞的细胞膜呈痘痕样凹陷)的出现率。
采用革兰氏阴性菌内毒素检测试剂盒测量血液中内毒素水平。
血常规检测红细胞(red blood cell，RBC)计数、白细胞(white blood cell，WBC)计数、血小板计数(platelet count，PLT)和血红蛋白(hemoglobin，HGB)水平。
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，所有数据以
±s表示，两组间比较采用t检验，不同组间两两比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。
脾切除组比脾血管结扎组的手术时间、手术失血量、胃肠道功能恢复时间显著增加，手术时间为(37.5±6.0)min比(22.5±6.0)min，P<0.001；手术失血量为(1.7±0.5)ml比(0.9±0.5)ml，P＝0.011；胃肠道功能恢复时间为(6.6±0.9)d比(5.1±1.0)d，P＝0.007。(图2)
正常组和对照组之间的IgA、IgG、IgM、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和TGF-β1水平差异无统计学意义(均P>0.05)。与正常组和对照组相比，脾血管结扎组和脾切除组的IgG、IgA和IgM水平显著降低，而其IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和TGF-β1水平均显著增加。脾血管结扎组的IgG、IgA、IgM、IL-2和TGF-β1水平显著高于脾切除组，而其IL-6和TNF-α水平显著低于脾切除组(表1)。
各组大鼠血清IgA、IgG、IgM、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平(pg/ml，
±s)
各组大鼠血清IgA、IgG、IgM、IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平(pg/ml，±s)
| 分组 | IgA | IgG | IgM | IL-1β | IL-2 | IL-6 | TNF-α | TGF-β1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 正常组 | 5.62±0.21ab | 211.06±13.18ab | 25.17±0.29ab | 125.79±5.57ab | 15.60±0.89ab | 1.25±0.06ab | 24.11±2.29ab | 32.08±0.89ab |
| 对照组 | 5.57±0.32cd | 220.16±9.38cd | 25.88±0.48cd | 124.60±7.31cd | 15.93±0.77cd | 1.27±0.04cd | 24.94±2.85cd | 32.13±1.39cd |
| 脾血管结扎组 | 4.46±0.15e | 171.68±10.05e | 20.81±0.86e | 246.24±10.28 | 34.44±1.24e | 1.95±0.05e | 50.08±4.26e | 52.82±2.09e |
| 脾切除组 | 4.11±0.14 | 154.20±8.67 | 15.85±0.41 | 267.90±28.10 | 30.72±1.44 | 2.14±0.07 | 56.75±4.54 | 47.14±3.67 |
注：Ig，免疫球蛋白；IL，白细胞介素；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；TGF-β1，转化生长因子-β1；正常组与脾血管结扎组相比，aP<0.001；正常组与脾切除组相比，bP<0.001；对照组与脾血管结扎组相比，cP<0.001；对照组与脾切除组相比，dP<0.001；脾血管结扎组与脾切除组相比，eP<0.001
正常组和对照组间的CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞所占比例和CD4+T/CD8+T细胞计数比值差异无统计学意义。与正常组和对照组相比，脾血管结扎组和脾切除组中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞所占比例均显著下降，而CD4+T/CD8+T细胞计数比值显著升高。脾血管结扎组的CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞所占比例和CD4+T/CD8+T细胞计数比值水平显著高于脾切除组(表2)。流式细胞术检测结果见图3，图4，图5。
各组大鼠各类T淋巴细胞计数占淋巴细胞总数比例(
±s)
各组大鼠各类T淋巴细胞计数占淋巴细胞总数比例(±s)
| 分组 | CD3+T淋巴细胞(%) | CD4+T淋巴细胞(%) | CD8+T淋巴细胞(%) | CD4+T/CD8+T细胞计数比值 |
|---|---|---|---|---|
| 正常组 | 64.7±0.4ab | 36.6±0.8ab | 31.1±0.7ab | 1.18±0.03ab |
| 对照组 | 64.5±0.4cd | 36.3±0.3cd | 31.4±1.1cd | 1.16±0.04cd |
| 脾血管结扎组 | 50.5±0.6e | 32.4±0.3e | 24.3±0.4e | 1.34±0.03e |
| 脾切除组 | 39.5±0.4 | 24.6±0.7 | 20.1±0.5 | 1.22±0.04 |
注：正常组与脾血管结扎组相比，aP<0.001；正常组与脾切除组相比，bP<0.001；对照组与脾血管结扎组相比，cP<0.001；对照组与脾切除组相比，dP<0.001；脾血管结扎组与脾切除组相比，eP<0.001
正常组和对照组间内毒素含量差异无统计学意义。与正常组和对照组相比，脾血管结扎组和脾切除组中内毒素含量显著增加。但脾血管结扎组的内毒素含量[(0.43±0.07)EU/ml]显著低于脾切除组[(0.60±0.08)EU/ml，表3]。
各组大鼠内毒素水平和痘痕红细胞出现率的比较(
±s)
各组大鼠内毒素水平和痘痕红细胞出现率的比较(±s)
| 分组 | 内毒素水平(EU/ml) | 痘痕红细胞出现率(%) |
|---|---|---|
| 正常组 | 0.13±0.01ab | 4.7±1.3ab |
| 对照组 | 0.13±0.01cd | 4.1±1.2cd |
| 脾血管结扎组 | 0.43±0.07e | 14.9±3.2e |
| 脾切除组 | 0.60±0.08 | 24.1±4.4 |
注：与脾血管结扎组相比，aP<0.001；与脾切除组相比，bP<0.001；与脾血管结扎组相比，cP<0.001；与脾切除组相比，dP<0.001；与脾切除组相比，eP<0.001
正常组和对照组间痘痕红细胞出现率差异无统计学意义。与正常组和对照组相比，脾血管结扎组和脾切除组中痘痕红细胞出现率均显著增加。但脾血管结扎组的痘痕红细胞出现率[(14.9±3.2)%]显著低于脾切除组[(24.1±4.4)%，表3]。
正常组和对照组间的RBC、WBC、PLT和HGB水平差异无统计学意义。与正常组和对照组相比，脾血管结扎组和脾切除组中RBC、WBC、PLT和HGB水平均显著增加。但脾血管结扎组的WBC、PLT和HGB水平显著低于脾切除组(表4)。
各组大鼠外周血血常规检测结果(
±s)
各组大鼠外周血血常规检测结果(±s)
| 分组 | WBC(×109/L) | RBC(×1012/L) | PLT(×109/L) | HGB(g/L) |
|---|---|---|---|---|
| 正常组 | 4.2±0.2ab | 4.0±0.3ab | 262±24ab | 158±8ab |
| 对照组 | 4.1±0.5cd | 4.8±0.7cd | 268±22cd | 166±10cd |
| 脾血管结扎组 | 12.1±2.6e | 7.6±1.6 | 460±31e | 241±10e |
| 脾切除组 | 19.6±3.6 | 10.1±1.9 | 735±51 | 301±11 |
注：WBC，白细胞计数；RBC，红细胞计数；PLT，血小板计数；HGB，血红蛋白水平；与脾血管结扎组相比，aP<0.001；与脾切除组相比，bP<0.001；与脾血管结扎组相比，cP<0.001；与脾切除组相比，dP<0.001；与脾切除组相比，eP<0.001
引发脾大和脾功能亢进的常见原因包括血液系统疾病[如遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis，HS)、地中海贫血、溶血性贫血等]和门静脉高压。分流手术可有效治疗门静脉高压引发的脾大和脾功能亢进，但血液系统疾病导致的脾大常需采用脾切除术治疗，目的就是通过切除脾减少红细胞在脾脏中的破坏，进而改善脾功能亢进状态。其中HS是导致儿童先天性脾大和脾功能亢进的重要原因之一，发病率约为1/2 000[3]。原则上只要诊断为HS，就有脾切除术的指征。但过早的脾切除术可降低免疫力，引发感染的风险增加，其中5岁以下儿童的爆发感染的发生率约为20%，显著高于成人，且全身感染比例是未切除脾儿童的60~100倍[4]。对全脾切除者术前常规注射肺炎球菌多糖疫苗预防术后感染，术后常规应用抗生素抗感染治疗，但这些方法并未降低术后感染的风险[5,6,7]。全脾切除术后，发生与脑膜炎相关的败血症风险高达5%，死亡率为1%~5%[8,9]。全脾切除术者有终生发生致命感染的风险[5]。另外，全脾切除术后门静脉系统血栓的发生率高达50%~80%，如不及时诊治将严重危及患儿或成年患者生命[10,11]。因此，脾切除术虽然是治疗脾大和脾功能亢进的最有效方法，但对于儿童来说，仍存在较大的风险。有鉴于此，对于患儿全脾切除术的适应证应该限制在极少数情况下，而保守性手术(如部分脾切除术和脾栓塞术)对于大部分患儿来说应该是第一选择[12]。
但保守性手术也并非无懈可击。与全脾切除术相比，部分脾切除术对于术者的手术技术要求更高，手术难度更大，术中术后脾创面出血的风险明显增大。而且部分脾切除术后仍有残脾再生引发复发的可能[13,14,15]。脾栓塞术虽然避免了开放手术的危险，具有微创恢复快的优势，但其作为一种介入操作，存在着术后肝肾功能损伤和栓剂外流引发异位栓塞的风险，尤其是门静脉系统的栓塞风险显著增加；并且难以评估栓塞面积导致栓塞不够引发复发风险[16]。因此，为了保留部分脾，减少手术创伤和并发症发生，本组首次提出腹腔镜脾血管结扎术作为一种新的保守性手术用于治疗儿童脾功能亢进疾病，并获得初步成功[1,2,17]。该术式操作简单(结扎脾动脉和大部分脾动静脉分支血管引发大部分脾梗死)、创伤小、出血风险低，最终保留了部分脾血运(保留胃短和胃后血管供应部分脾)。尽管脾血管结扎术保留了部分脾血运，但最终能否保留脾的功能(包括免疫功能、脾清除功能和抗感染能力)，暂未见相关报道。
机体免疫功能包括细胞免疫和体液免疫，其中采用T淋巴细胞比例评估细胞免疫功能，采用免疫球蛋白水平评估体液免疫功能。本研究发现，脾切除术和脾血管结扎术后的IgG、IgA和IgM水平、CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比显著低于正常组和对照组，表明脾切除术和脾血管结扎术均显著降低了机体的免疫功能，这是全脾切除术后容易出现败血症和爆发性感染风险的内在机制。但脾血管结扎组的IgG、IgA、IgM、CD3+T、CD4+T、CD8+T和CD4+T/CD8+T水平显著高于脾切除组，表明脾血管结扎组的机体免疫功能较脾切除组好，脾血管结扎术具有保留部分机体免疫功能的作用。
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁中的脂多糖成分，由革兰氏阴性菌引起的内毒素血症及脓毒症目前仍是临床上病死率较高的疾病。因此检测体液中内毒素水平是监测细菌性炎症的一个重要特异性指标，也是监测炎症活动的参数。尤其对于脾切除术后爆发性感染的检测有重要的临床价值。本研究发现，脾切除术和脾血管结扎术后内毒素含量显著高于正常组和对照组，表明术后抗感染能力显著减弱，更容易被细菌感染。但脾血管结扎组的内毒素含量显著低于脾切除组，表明脾血管结扎术后的抗感染能力较脾切除术强，导致被细菌感染的机会较脾切除组低。
临床上采用痘痕红细胞(由于示差显微镜下痘痕红细胞的细胞膜呈痘痕样凹陷而得名，实际上是由于光密度不同所致的光感错觉，这些痘痕是电镜下所见到的红细胞内的空泡)的检测来评价脾清除功能。正常人痘痕红细胞出现率为0~3‰，无脾时高达16%~51%。痘痕红细胞的检测，可作为判定有效脾组织存在与否及其功能强弱的指标。本研究发现，脾切除术和脾血管结扎术后痘痕红细胞出现率显著高于正常组和对照组，表明术后脾清除能力减弱，但脾血管结扎组的痘痕红细胞出现率显著低于脾切除组，表明脾血管结扎术后的脾清除能力较脾切除术强。
脾功能亢进常引发RBC、WBC计数和PLT降低，临床上称为"三系减少"，是典型的脾功能亢进表现。因此常用"三系"的变化情况评估脾功能亢进的严重程度。本研究发现，脾切除术和脾血管结扎术后RBC、WBC、PLT和HGB均显著高于正常组和对照组，表明手术能够改善脾功能亢进情况；但脾血管结扎组的WBC、PLT和HGB显著低于脾切除组，而两组间的RBC计数差异无统计学意义，表明脾血管结扎术在改善脾功能亢进方面的效果没有脾切除术显著，这是由于其保留部分脾所致。但脾血管结扎组的"三系"显著高于正常组和对照组，表明脾血管结扎组仍可以有效改善脾功能亢进。
综上所述，脾血管结扎术在有效改善脾功能亢进的基础上具有保留部分机体免疫功能、脾清除能力和抗感染能力的积极作用，较脾切除术在保留脾功能方面更有积极作用。因此，其在治疗儿童脾疾病方面也是一个可行的选择。
所有作者均声明不存在利益冲突
