胆道闭锁(biliary atresia，BA)是一种累及肝内外胆管的严重肝胆疾病，以早期快速进展的肝纤维化和肝外胆管炎症性纤维化闭锁为主要病理特征，其病因不明、发病机制不清。实验模型是BA研究中必不可少的工具。近年来，学者们利用BA实验模型进行了大量基础研究，为疾病的病因、发病机制和治疗提供理论依据。本文就小鼠、斑马鱼、七鳃鳗和类器官体等实验模型在BA中的进展做一综述，以期为BA基础研究提供参考。
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胆道闭锁(biliary atresia，BA)是一种进行性、炎症性、纤维硬化性的胆管疾病，病变可累及肝内和肝外胆管，严重时可进展为肝硬化甚至是肝衰竭[1]。该病多见于新生儿和婴儿，且病因尚不明确。目前首选的治疗方法为Kasai手术，部分患儿术后肝纤维化持续进展、肝功能恶化，需要进一步接受肝移植手术，如不接受治疗，大多数患儿将在1岁内死亡。20世纪60年代中期，因为缺乏合适的实验模型对BA进行深入研究，所以研究者开始探索BA动物模型[2]。借助这些动物模型，人们能够针对BA发病机制、病因以及治疗等各方面展开研究，并提出了多种可能的病因学说，如病毒感染、中毒性损伤、胆管发育畸形和自身免疫介导胆管受损等[3]。本文就小鼠、斑马鱼、七鳃鳗和类器官体这几类在BA研究中应用相对较多的实验模型进行文献综述，以期为BA的基础研究提供新的切入点。
小鼠是动物实验中最常用的模型，在BA的疾病研究中也不例外。该病相关的小鼠模型主要包括腹腔注射病毒模型、胆管结扎模型以及化学药物诱导模型。
围生期病毒感染诱发的宿主炎性反应很可能是BA的致病原因之一。其中，巨细胞病毒和轮状病毒是BA研究中最受关注的两种病毒[4]。而BA最成熟的动物模型是感染恒河猴轮状病毒(rhesus rotavirus，RRV)的新生BALB/c小鼠模型[5]。1993年，Riepenhoff-Talty等[6]发现RRV可以诱导小鼠出现胆管阻塞、炎症浸润等类似于BA的肝脏变化，这是BA实验性研究的初步突破。而这一模型成功的关键在于易感的小鼠品系(BALB/c小鼠)、最佳的腹腔注射感染时间(产后24 h)以及高剂量的RRV诱导[7]。
轮状病毒可以直接对细胞造成损伤，在其编码的非结构蛋白4(nonstructural protein 4，NSP4)与表达于肝外胆管上皮细胞表面的整联蛋白α2β1相互作用后，会导致肝外胆管上皮细胞的损伤[8]。除了轮状病毒对细胞的直接损伤，还有一种导致BA的原因是轮状病毒激活了免疫炎症反应。其中，炎症反应的主要表现为淋巴细胞活化和靶向肝外胆管的炎性因子的分泌[9]。Huang等[10]证实TLR7激活可触发BALB/c小鼠先天免疫通路，诱导胆管凋亡和发育不良。Shimada等[11]在BA患儿的组织中发现TLR3信号传导是通过胆管细胞中的NF-κB和IRF3诱导CCL5表达来诱发炎症，进而破坏胆管。
RRV小鼠模型在BA的治疗研究上应用广泛，Zhang等[12]运用RRV小鼠证实银纳米粒子通过上调转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)对BA起到治疗作用。Lei等[13]证实了骨髓间充质干细胞在RRV小鼠中的抗纤维化潜能，为改善BA患儿的肝纤维化提供了一种新的治疗手段。Möhn等[14]在RRV小鼠中证实类维生素A能够有效抑制γδT细胞白细胞介素(interleukin，IL)-17的产生，从而改善BA小鼠的肝脏炎症，在BA患儿的治疗方案中加入类维生素A可能会减少疾病负担。
目前，RRV小鼠BA模型尚存在以下问题：①生存时间短，不能研究BA的晚期纤维化过程；②体积小，不适用于需要血清样本或者大量组织活检标本的实验；③停止注射会逆转梗阻过程。针对RRV病毒诱导模型生存时间短和阻塞胆管易再通的缺陷，人们采取基因重组的方法进行改良。Mohanty等[15]生成了一种新型RRV-TUCH轮状病毒重配株，当注射到新生小鼠体内时，诱发了一种病死率较低的BA模型，且有63%的存活小鼠发展为Ishak 3~5期纤维化。这种改良模型给研究BA的发病机制和治疗提供了更多的机会，是一个值得去深入探索的领域。
1957年，Symeonidis和Trams[16]建立了一种结扎成年大鼠胆总管的BA模型。此BA模型有胆汁淤积和胆管增生等病理改变。2017年，Hua等[17]在胆管结扎小鼠模型中证实HIF-2α参与胆汁淤积介导的肝细胞凋亡。但这一模型存在下述问题：①通过结扎或者切除胆管来建造的BA模型与人类BA症状仍有区别；②对动物的选择以及实验操作要求较高，最终的结果并不理想[18]。对于化学药物诱导模型，Dumont等[19]通过胆总管注射福尔马林来诱导胆管炎，但该模型并没有引起肝细胞的损伤，与BA的病理改变有所差异。腹腔注射四氯化碳虽然能够使小鼠肝脏出现肝纤维化和肝硬化这种与人类BA相似的病理改变，但最终也未形成BA[20]。基于无水乙醇胆总管注射的模型引起的肝内胆道病理特征与BA相似，但其形成肝纤维化的进程慢且不能进展为肝硬化，所以该模型对BA研究的帮助不大[21]。并且实验动物对这些化学药物的个体差异性大，注射药物后短期死亡率高。人群中也很少存在这类化学药物中毒的报道，所以很难证明这些化学药物是BA的病因。
总体而言，由于化学药物诱导模型和胆管结扎模型与人类BA的形成存在着较大差异，所以本文认为它们并不是探究BA病因和发病机制的合适模型。RRV小鼠模型对于阐明BA发病机制和寻找有效的治疗手段有着很大的帮助，但轮状病毒感染是否会导致人类BA仍存在争议，也有学说认为轮状病毒感染是BA后期的继发感染[7]。
斑马鱼是研究肝脏生理学的重要模型，因为除了肝巨噬细胞外，胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞、肝原驻免疫细胞等都已在斑马鱼中被鉴定与哺乳动物的结构和功能相似[22]。并且随着光学成像技术的发展，人们可以利用肝脏的共焦成像，经过三维渲染后获得胆管网络的全面视图，从而对斑马鱼的胆管系统进行研究[22]。
斑马鱼在组织和器官发育上与人类具有高度的形态和分子相似性，加之其基因功能易于研究，斑马鱼成为GWAS确定的筛查病因的理想模型[22]。国外的学者们在GWAS中发现了多个BA易感基因，此前已经证实分别敲除ADD3、GPC1和ARF6这三种易感基因，都会导致胆道发育不良[23]。ILF2、man1a2以及纤毛基因与胆管发育之间的联系也是最近研究的热点问题。Cheung等[24]通过CRISPR/Cas9方法敲除斑马鱼的ILF2，发现ILF2是胆道发育所必需的基因，即ILF2缺失会损害胆管发育。Lam等[25]通过CRISPR/Cas9设计的斑马鱼模型发现，纤毛基因突变导致胆管细胞纤毛畸形和功能障碍可能是BA发病的关键机制。So等[23]在斑马鱼胚胎man1a2敲除模型中，发现存在胆道系统和肝巨噬细胞囊泡纤毛发育不良，发育基因egfra的失调以及心脏、肝脏的异位，同时也证实人类BA肝脏和man1a2缺失肝脏都会导致人类多系统侧性缺陷的问题。
胆道系统由肝外胆管、肝内胆管、囊性胆管和胆总管这些连接肝脏、胆囊和消化道的导管网络所构成。胆道系统肝内和肝外成分的平衡对胆汁运输是至关重要的，而信号转导通路对斑马鱼胆道系统发育存在调控作用。Brandt等[26]通过斑马鱼sav1和stk3突变体证明Hippo-Yap/Taz在肝内和肝外胆管发育中的重要作用。这一通路同时也在RRV小鼠模型中证实与胆管增生及肝纤维化密切相关[27]。Tang等[28]进一步发现ADD3敲除引起的胆道缺陷可能与Hedgehog信号通路有关，抑制Hedgehog信号通路可以修复由ADD3敲除引起的胆道缺陷。Notch信号通路能够调节斑马鱼的胆管形成，这一结果同时也在RRV小鼠模型中被证实[9,29]。在此基础上，So等[30]在斑马鱼模型中发现Wnt/β-catenin信号通路通过调节肝细胞中Notch配体基因的表达，非自主地控制胆管上皮细胞中的Notch活性，从而调节胆管形态发生。
澳大利亚的部分干旱地区曾爆发了牲畜的BA，摄入某种特定植物的成年动物所生产的幼崽患上BA，而成年动物本身不受影响[31]。这种植物产生的有毒化合物被称为胆闭素，也是已知的第一种能选择性破坏肝外胆管的毒素[32]。Lorent等[31]从刺藜属(Dysphania)植物中分离出胆闭素，发现斑马鱼幼体暴露于胆闭素后，会出现肝外胆管损伤，与在人类BA中观察到的病理非常相似。Zhao等[33]在谷胱甘肽代谢基因靶向突变的斑马鱼幼鱼的实验中证实谷胱甘肽代谢的区域差异是胆闭素敏感性的基础，并且可能是BA与谷胱甘肽代谢基因表达之间关联的原因。目前已经证明胆闭素对斑马鱼肝外胆管的损伤作用，深入探索胆闭素对人类BA的影响，可能为BA研究提供新的切入点。
总体而言，斑马鱼已成为研究人类肝脏疾病的优秀模型。与其他模型相比，斑马鱼胚胎和幼鱼提供了下述优势[22,34,35,36]：①斑马鱼受精后72 h肝细胞成熟，5 d时肝脏功能完善，如此快速的生长发育过程便于研究器官生长分化；②幼鱼通体透明，在光学显微镜下可以观察不同阶段中器官的发育；③造模简单，可以通过在养殖水中添加各种化合物进行造模；④细胞板培养可获得大量样本，便于化学和遗传筛选；⑤斑马鱼的突变体或者转基因品种丰富。但与所有的实验模型一样，斑马鱼模型也存在局限性[5,22,36]：①胚胎时期的斑马鱼模型干细胞分化潜能存在差异，成年斑马鱼分化潜能弱；②斑马鱼体型过小不利于进行手术操作；③不适用于需要血清样本或者大量组织活检标本的实验；④幼鱼表型可能只模仿肝脏疾病早期阶段，没有足够的时间发展为肝纤维化和肝硬化。⑤适应性免疫系统在幼鱼阶段不成熟，对疾病进展的信息有限；⑥基因敲除仅仅构建出了胆道发育异常的模型，并未真正出现BA的全部病理表现。这些缺陷导致斑马鱼并不适用于BA治疗相关方面的研究，但这并没有减弱斑马鱼在BA研究中的重要性。斑马鱼幼鱼生长发育迅速和光学透明性等特点有助于BA的病因和发病机制研究，特别是在测试来自GWAS的BA易感基因、探索胆管相关信号通路以及探究胆闭素对胆管发育的影响等方面。
七鳃鳗类动物是唯一一种在生长发育环节自然发生胆管退化的脊椎动物，其生长周期包括幼体、变态期、成体三个阶段[18]。在变态发育时，七鳃鳗失去了胆囊和胆管，形成了类似于人类BA过程的永久性胆管阻塞和变性[37]。与其他模型相比，七鳃鳗与哺乳动物的肝脏具有相似的组织学结构和超微结构。且七鳃鳗在造模过程中，无需通过注射药物或其他处理，就能够发生胆管退化，是人们研究BA的病因学及治疗的关键模型。
七鳃鳗的变态发育历经了七个阶段，即M1~M7期。过去认为BA从M2开始，到M6完成，现在大多数学者认为这一改变在M1期就有所体现[38]。其中，基底膜在M1和M2出现组织学改变，在M3和M4发生显著重组。肝内和肝外胆管退变也有一定的区别：肝外胆管和胆囊在M3完全退变，而1~2条肝内胆管可能持续到M5和M6，通常最迟在M7消失[2]。在M5时除了会有胆管的退变，还会存在肝细胞增殖和重组增加[39]。此外，肝脏、肾脏和肠道也在M3到M7期间进行重构和重组[39]。Chung-Davidson等[3]通过改良的CLARITY方法观察变态发育的七鳃鳗肝脏以及与肠道的连接处，利用激光扫描共聚焦显微镜观察了七鳃鳗变态过程中胆管退化的过程。该团队还通过七鳃鳗的动物模型发现Hsp90参与了胆管退变、肝细胞再生、胆汁酸合成[40]。最近的研究也显示，TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、MAPK信号通路以及Wnt信号通路均参与了七鳃鳗胆管和胆囊退化的过程，而干扰TGF-β信号通路可以让胆管和胆囊退化的进程减缓[39]。
与BA患儿不同，七鳃鳗模型中出现的短暂胆汁淤积并不会进展为肝硬化和肝衰竭，反而会通过特殊的代偿机制来适应这种发育状态[3]。阐明这些代偿机制，会为BA的治疗提供新的思路。
成年七鳃鳗似乎通过减少胆盐合成来避免血浆中胆盐的积累，而胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)是胆盐生物合成中的限速酶。有研究发现，CYP7A1在成年七鳃鳗肝脏中的表达下调，在肠道中的表达却有所增加[40]。这表明变态期的七鳃鳗可能将胆盐合成的部位从肝脏转移到肠道。但CYP7A1的下调后，胆汁淤积仍会使肝脏受损，所以尚存在其他的代偿机制来调节胆汁淤积的状态[2]。
七鳃鳗的胆盐有多种类型，其中硫酸石油霉素(petromyzonol sulfate，PZS)作为主要的类型，可分为C24和C27两种形式，而C24比C27具有更强的毒性[38]。成年雌性七鳃鳗可将肝内的主要胆盐C24胆盐转化为C27胆盐来降低肝内胆汁淤积程度；而成年雄性七鳃鳗在HSD3B7的调控下将有毒的PZS转化为无毒的3-酮-硫酸石油霉素并从鳃排出[41]。
胆绿素是一种典型的胆色素，具有抗氧化作用，可以有效地降低胆盐的毒性作用。研究显示，成年七鳃鳗有较高的胆绿素水平，有着较强的肝脏保护作用[38]。
类器官体是3D培养的微型器官，它可以模拟细胞之间的相互作用和结构，所以被越来越多地用于BA、原发性硬化性胆管炎和胆管癌等胆管疾病的研究[43]。肝脏或胆管类器官体可以由多种细胞来源生成，包括诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、肝祖细胞、肝活检的原代细胞、无限增殖化细胞以及组织来源细胞等[43]。
多位学者证明了BA类器官体呈现的胆道特征与BA相似。Tian等[44]使用CRISPR/Cas9敲除BA相关基因ADD3和GPC1，发现类器官体表现为胆道分化的缺乏和纤维化的增加，具体呈现为胆管结构的形成明显减少，胆道标志物(CK7、EpCAM、SOX9、CK19、AE2和CFTR)表达减少，纤维化标志物(α-平滑肌肌动蛋白、赖氨酰氧化酶样蛋白2和胶原蛋白1)的表达增加。Amarachintha等[45]证实了BA类器官体存在发育标志物表达较少、纤毛定向错误、缺乏胆管细胞样细胞核基底定位、EGF信号传导和FGF2信号传导相关的基因表达下降的现象，当进行EGF和FGF2处理后可逆转这些表现。
类器官体的使用让研究者对BA有了一些新的理解和认识。Babu等[46]通过结合类器官体和转录组分析发现BA患儿肝脏中β-淀粉样蛋白在胆管周围积聚，而阿尔茨海默病和脑淀粉样血管病也会存在β-淀粉样蛋白，可能会探索到一种新的发病机制，具有重要的诊断和治疗意义。Chen等[47]不仅找到了轮状病毒在人胆管类器官体中诱导BA的因果证据，还证明了霉酚酸、干扰素和轮状病毒VP7蛋白的中和抗体对胆管类器官体中轮状病毒的抑制作用。
前文已经提及胆闭素对斑马鱼肝外胆管的损伤作用，最近学者们在胆管类器官体中也应用了胆闭素。国内学者通过对BA患儿胆囊来源的胆管细胞和胆管扩张症胆囊来源的胆管细胞采用三维原代胆管细胞进行培养，发现胆管类器官体在体外培养时可以长期维持较稳定的基因表达水平，并且加入人工胆闭素后，可以使实验组的胆管类器官体死亡[48]。此外，Sophia等[49]使用胆管类器官体发现还原性谷胱甘肽的降低产生了胆闭素相似的作用，两者均通过上调RhoU/Wrch1来介导Notch信号通路中Hey2的表达增加，进而下调转录因子SOX17，导致了胆管细胞单层损伤和通透性增加。
大多数BA类器官体都是肝外胆管模型，然而Chusilp等[50]通过用健康新生幼鼠肝脏首次制备出肝内胆管类器官体，表明胆管细胞凋亡及其纤维化反应可能在BA等胆管疾病的纤维化过程的启动中起作用，该模型也对BA的研究具有重要价值。
无论是二维单层培养的细胞还是三维培养的类器官体都无法全面复制胆管的结构组织，也无法再现重要的组织生理功能[51]。而在类器官体基础上衍生出的生物工程胆管模型恰好能解决这一问题。
Yu等[52]为了捕捉胆管的结构和环境，使用了具有可控结构和周围基质的微工程胆管芯片上的器官技术——胆管作业芯片。它不仅在三维空间中模拟了胆管的管状结构，而且还模拟了它的屏障功能。该装置能够独立地进入胆管细胞通道的顶端和基底外侧表面，允许使用药物进行毒性研究。他们发现通常暴露于胆汁顶端表面的多糖蛋白复合物具有保护作用，且胆管细胞是机械敏感的。然而，Xiao等[53]却有着完全不同的看法，他们认为与顶端给药相比，在基地外侧表面给药对胆管芯片的损害更严重；并提出在胆管上皮细胞免疫染色后再进行实验，可以更直观地评估胆管细胞损伤的程度。尽管此模型尚不完善，但在对胆管的生理及病理上的研究仍具有巨大的潜力。
此外，还存在多种生物工程胆管模型，Sampaziotis等[54]在肝外胆管细胞类器官体的基础上植入了生物可降解支架，形成了组织状结构。由此可以保留胆管的特征，并且移植到小鼠损伤模型后可以重建胆囊壁并修复胆管上皮。Chen等[55]将类器官体衍生的胆管细胞与胶原包被的聚醚砜中空纤维膜结合，制作了一个形态与天然胆管相似的生物工程胆管，并具有极化胆汁酸转运活性，可以用来研究和调节胆管细胞功能。
总体而言，类器官体是能够用于研究BA病因、发病机制和治疗的优秀模型。而且在其基础上加以改良的生物工程胆管模型还能以可控的方式模拟组织中细胞和细胞外基质连接，从而实现实时的高分辨率成像和生化代谢分析。相信在不远的将来，生物工程与医学的结合也是BA这一领域研究的重点。
人们一直以来在不断尝试建立各种动物模型来模拟BA，以期突破临床实验上的障碍，取得病因、发病机制和治疗上的进展。RRV小鼠模型和斑马鱼模型在BA实验中运用广泛，且RRV重配株模型的出现弥补了RRV小鼠模型的不足，为BA研究提供了一种更加优秀的模型。七鳃鳗类是自然发生胆管退化的模型，但目前国内外在此模型基础上的BA研究较少，值得研究者对该模型进行深入探索。类器官体作为一种非常有前景的模型，在近年来的使用逐渐增多，其与生物工程的结合也说明了多学科知识的融合是今后的发展趋势。总之，随着对BA实验模型的深入探索和研究，未来人们在BA的病因、发病机制与治疗方面一定会有新的突破。
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