评估同种异体胰岛移植治疗1型糖尿病的3年随访结果。
对10例1型糖尿病患者(T1DM)施行同种异体胰岛移植。以Liberase酶消化，COBE 2991型专用胰岛细胞分离机分离及连续密度梯度纯化，获取高纯度与高活性的胰岛。采用经皮肝门静脉穿刺，胰岛悬液重力输注，将短期培养的胰岛经门静脉移植到肝脏内。术后采用兔抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(ATG)、注射用依那西普联合应用他克莫司＋吗替麦考酚酯的改良Edmonton免疫抑制方案，随访3年，定期监测受者血糖、C肽与糖化血红蛋白的水平。
随访36个月，6例完全撤除胰岛素治疗，4例胰岛素用量较术前减少60%以上。术后血糖稳定维持在正常水平，C肽均在正常范围内，糖化血红蛋白基本正常，肝肾功能稳定维持正常，无胰岛移植并发症发生。
同种异体胰岛移植治疗1型糖尿病3年期临床疗效较好，手术简捷，创伤小，安全性高，远期疗效尚需进一步观察。
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糖尿病(DM)是目前严重威胁人类健康的全球性重大疾病之一，现有的胰岛素替代治疗无法阻断糖尿病对全身多器官的微血管损害。特别是1型糖尿病(T1DM)多发生于儿童或青少年，起病急骤。传统治疗方案中外源性胰岛素使用存在一些缺陷，胰岛素剂量不足易发糖尿病酮症酸中毒，而胰岛素剂量过大可以导致低血糖发作，严重者出现低血糖昏迷。胰岛移植是目前最有可能治愈1型糖尿病的有效方法[1]。现将我院10例T1DM患者施行同种异体胰岛移植，且术后随访3年的临床资料总结报告如下。
2011年1月至2012年12月我院共对10例T1DM患者施行了同种异体胰岛移植，其中男性7例，女性3例，平均年龄28.6岁(14～48岁)，临床确诊T1DM后平均病程17.3年(8～21年)。10例受者均按国际青少年糖尿病研究基金会(JDRF)标准筛选为胰岛细胞受者。术前使用胰岛素5～18年，术前胰岛素平均用量46.2 IU/d(30～62 IU/d)。10例受者术前均多次出现低血糖或酮症酸中毒症状发作，术前检查空腹C肽为0.1～0.4 μg/L，餐后2 h C肽为0.1～1.1 μg/L。10例受者中，术前蛋白尿阳性4例，眼底病变6例，按照国际临床糖尿病性视网膜病变严重程度的分级标准Ⅰ级1例，Ⅱ级3例，Ⅳ级2例(表1)。
10例1型糖尿病患者胰岛移植后不同时期胰岛素用量及并发症改善情况(
±s)
10例1型糖尿病患者胰岛移植后不同时期胰岛素用量及并发症改善情况(±s)
| 病例 | 术前胰岛素平均用量（U/d） | 移植胰岛数量(IEQ) | 术后不同时间的胰岛素用量(U/d) | 撤除胰岛素时间(月) | 36月胰岛素减量比例(%) | 24h尿蛋白(g) | 眼底病变分期 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1月 | 2月 | 3月 | 6月 | 12月 | 24月 | 36月 | 术前 | 术后36个月 | 术前 | 术后36个月 | |||||
| 例1 | 30 | 490 000 | 18 | 8 | 0 | 0 | 0 | 6 | 6 | 3 | 80 | － | － | － | － |
| 例2 | 40 | 460 000 | 22 | 16 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 100 | 2.12 | 0.98 | Ⅳ | Ⅳ |
| 例3 | 52 | 505 200 | 38 | 26 | 20 | 12 | 12 | 12 | 14 | 0 | 73.1 | － | － | Ⅰ | － |
| 例4 | 35 | 450 000 | 26 | 12 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 100 | 0.88 | － | － | － |
| 例5 | 48 | 480 000 | 32 | 20 | 10 | 6 | 0 | 0 | 0 | 5 | 100 | － | － | Ⅱ | － |
| 例6 | 40 | 515 000 | 26 | 20 | 16 | 16 | 14 | 14 | 16 | 0 | 60.0 | 1.02 | － | － | － |
| 例7 | 62 | 582 000 | 42 | 36 | 30 | 30 | 22 | 22 | 20 | 0 | 67.8 | 2.66 | 1.24 | Ⅳ | Ⅲ |
| 例8 | 30 | 465 000 | 20 | 12 | 8 | 0 | 0 | 6 | 8 | 6 | 73.3 | － | － | Ⅱ | Ⅰ |
| 例9 | 50 | 565 200 | 38 | 20 | 12 | 8 | 0 | 0 | 0 | 10 | 100 | － | － | － | － |
| 例10 | 60 | 505 000 | 48 | 36 | 30 | 22 | 16 | 14 | 14 | 0 | 76.7 | － | － | Ⅱ | － |
胰岛均取自于成人心脏死亡器官捐献(DCD)供者，采用标准的腹部多器官联合快速切取技术获取供胰，经供者腹主动脉和门静脉双重灌注4 ℃的UW液(美国诺华公司)3L，获取器官需保留部分十二指肠、脾脏及胰腺完整性，于4 ℃下保存于UW液中送至我院胰岛分离(GMP)实验室，保证供胰冷缺血时间<8 h。
常规检查胰腺，排除肿瘤，判断胰腺的质地，以及脂肪含量和血液含量等。初步评估胰腺可用后，在无菌冰水浴方盘中对胰腺修整，去除胰腺周围血管、结缔组织、脂肪组织后称重。在胰头、颈交界处横断，分别经主胰管插管固定，以120 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)压力下经主胰管插管注入Liberase酶(德国SERVA公司)液200 ml，使胰腺组织均匀膨胀，随后置于Ricordi系统中于37 ℃下消化，再使用COBE2991型细胞分离机进行连续密度梯度离心、纯化，并收集纯化的胰岛，置于22 ℃含体积分数95%的CO2孵箱中培养，并取样本进行质量和安全性评估。
对胰岛样本的质量、安全性、细胞活性进行评估，具体指标数据详见我们之前文章报道[2]，符合标准后进入移植程序。具体检测方法如下：(1)胰岛计数及纯度鉴定，采用双硫腙(DTZ)染色方法统计不同直径的胰岛数量，计算胰岛当量(IEQ)及纯度。(2)胰岛活性的鉴定，以双醋酸荧光素(FDA)/碘丙啶(PI)荧光染色，计数活细胞百分比。(3)胰岛功能的鉴定，以葡萄糖刺激试验(GSIS)检测胰岛素释放指数(SI)。(4)病原学检查，取胰岛悬液进行病原学检测，包括细菌革兰染色、细菌培养、真菌培养及支原体检测等。(5)内毒素水平检测，采用动态浊度法。上述5项指标中有任1项不达标者，不能用于移植。
选择与供者ABO血型一致的受者接受胰岛移植，同时排除合并有肿瘤、感染(获得性人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒或细菌性)及门脉高压症等的受者。在受者及其家属签署知情同意书后准备移植。从培养箱取出胰岛悬液，再次离心、清洗，加入胰岛专用移植液(美国Sigma公司)200 ml，并按受者体重加入肝素(35 IU/kg)。将受者送至介入手术室，在超声引导下经皮穿刺肝门静脉主干置管，胰岛悬液以自然重力输注，移植到受者肝脏内。移植过程控制在30～40 min内完成，同时连续监测门静脉压和血糖的变化，受者门静脉压均在正常范围内(<20 cmH2O)。术后回病房，观测受者血糖、尿糖、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)等指标的变化，以及腹部体征变化排除肝穿刺处出血，术后住院治疗10 d。
10例受者均采用改良的Edmonton免疫抑制方案，具体如下，(1)免疫诱导治疗方案：采用兔抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(ATG-F)100 mg(日本安斯泰来公司)，术前30 min及术后7 d各静脉注射1次。术前2 h内皮下注射依那西普(美国辉瑞制药有限公司)50 mg，术后第3、7、10天再分别每日皮下注射依那西普25 mg。(2)免疫抑制治疗方案：联合应用他克莫司(1 mg/d)＋吗替麦考酚酯(1 g/d)。术后1个月根据血他克莫司浓度调整剂量，将血他克莫司浓度控制在3～5 μg/L。根据受者血糖水平及血他克莫司浓度等因素综合考虑吗替麦考酚酯的用量。
术后3 d内给予抗生素、抗真菌、抗病毒、抑酸、降低门静脉压、防止门静脉血栓形成等预防性用药。检测受者血糖的变化，根据血糖水平应用长效胰岛素1个月，严格将血糖水平控制在7.8 mmol/L以下，尽可能减少刺激移植胰岛在术后早期(1月内)分泌胰岛素，从而避免移植胰岛因"过度疲劳"发生凋亡或死亡。所有受者术后降糖方案除根据监测血糖使用适当剂量外源性胰岛素外，均未使用其他口服降糖药物。术后3 d，每2～4 h监测血糖1次，恢复正常饮食后，餐前2 h、餐后2 h及睡前各测血糖1次；每天检测肝、肾功能。术后7 d行彩色多普勒超声检测肝脏和门静脉系统，排除门静脉高压及血栓。每周测空腹C肽、餐后C肽、血常规及肝、肾功能，每2～3个月检测糖化血红蛋白、胰岛素抗体，每周监测免疫抑制剂血药浓度，稳定后每个月测定1次，根据结果调整他克莫司用量。每6个月检查24h尿蛋白定量及眼底荧光血管造影检查各1次。
采用SPSS(19.0版)软件包对数据进行统计描述和处理。计量资料以均数±标准差(
±s)表示。餐前与餐后C肽值的差异采用配对t检验进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。
所有供胰均成功分离出胰岛细胞。10例受者接受胰岛细胞数量平均为501 740 IEQ(450 000～582 000 IEQ)，纯度平均为49.8%(38.5%～65.0%)，活率平均为96.2%(95%～97%)，刺激指数平均为4.14(2.8～5.4)。病原学(细菌革兰染色、细菌培养、真菌培养、支原体)检测及内毒素检测结果均为阴性。
10例受者术后在正常饮食下严格控制血糖至7.8 mmol/L以下，其术后不同时间所需胰岛素用量见表1。其中6例12个月内完全停用胰岛素(2例于术后24个月开始注射少量胰岛素)，其余4例术后36个月内胰岛素减量比例均超过60%。胰岛移植总体治疗有效率为100%，术后12个月胰岛素撤除率为60.0%(6/10)，术后36个月胰岛素撤除率为40.0%(4/10)。
与术前相比，10例受者术后空腹和餐后2 h的C肽水平均有升高，术后36个月内随访均在正常水平(0.78～5.19 μg/L)，C肽阳性率100%，与术前比较，差异具有统计学意义(P＝0.000，表2)。
10例1型糖尿病患者胰岛移植前后不同时间C肽水平的变化(
±s)
10例1型糖尿病患者胰岛移植前后不同时间C肽水平的变化(±s)
| 随访时间 | 例数 | C肽含量(μg/L) | t值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 空腹 | 餐后2 h | ||||
| 术前 | 10 | 0.16±0.18 | 0.25±0.14 | 1.524 | 0.182 |
| 术后1个月 | 10 | 0.49±0.21 | 1.14±0.31 | 2.492 | 0.021 |
| 术后3个月 | 10 | 0.87±0.28 | 1.56±0.38 | 2.672 | 0.000 |
| 术后6个月 | 10 | 1.15±0.39 | 1.69±0.49 | 2.683 | 0.014 |
| 术后12个月 | 10 | 1.26±0.38 | 1.76±0.58 | 2.794 | 0.000 |
| 术后24个月 | 10 | 1.29±0.41 | 1.83±0.62 | 2.972 | 0.002 |
| 术后36个月 | 10 | 1.21±0.48 | 1.76±0.61 | 2.662 | 0.008 |
| F值 | 21.384 | 36.400 | |||
| P值 | 0.000 | 0.000 | |||
注：t值为空腹与餐后2 hC肽水平的比较
术后随访36个月内，10例受者的糖化血红蛋白水平均有明显下降，并低于术前水平(10.38±2.21)%，差异有统计学意义(P＝0.000，表3)。
10例1型糖尿病患者胰岛移植前后不同时间糖化血红蛋白水平的变化(
±s)
10例1型糖尿病患者胰岛移植前后不同时间糖化血红蛋白水平的变化(±s)
| 随访时间 | 例数 | 糖化血红蛋白(%) |
|---|---|---|
| 术前 | 10 | 10.38±2.21 |
| 术后1个月 | 10 | 7.23±2.11 |
| 术后3个月 | 10 | 6.85±1.56 |
| 术后6个月 | 10 | 5.66±1.83 |
| 术后12个月 | 10 | 6.53±1.72 |
| 术后24个月 | 10 | 7.61±2.27 |
| 术后36个月 | 10 | 8.82±2.50 |
| F值 | 18.642 | |
| P值 | 0.000 |
10例患者中，术前检查发现蛋白尿阳性4例，其中2例24 h尿蛋白定量分别为0.88和1.02 g，而在术后36个月时24 h蛋白尿量均<0.15 g；另2例分别由术前的2.12 g和2.66 g分别下降至术后36个月时的0.98 g和1.24 g。术后36个月时，按照国际临床糖尿病性视网膜病变严重程度的分级标准术前存在眼底病变的6例受者中，1例Ⅰ级受者恢复正常；3例Ⅱ级受者中2例恢复正常，1例好转(降至Ⅰ级)；2例Ⅳ级受者中，1例好转(Ⅲ期)，1例无明显变化(表1)。
10例受者住院及随访期间经彩色多普勒超声监测均未发现肝脏和门静脉系统异常，肝、肾功能正常，未发生酮症酸中毒及低血糖等症状。10例受者术后均未发生急性排斥反应、感染等并发症。
T1DM是多种因素引起的胰岛B细胞损伤与凋亡，致胰岛素分泌量绝对不足而出现能量代谢紊乱为主要特征的自身免疫性疾病。其发病年龄小，常出现酮症酸中毒和低血糖昏迷等严重并发症，病情发展最终可导致多器官微血管病变而危及生命[3]。近年来，随着生活水平提高以及环境因素的影响，T1DM的发病率在全球呈明显上升趋势。胰岛移植既避免胰腺移植给患者带来的巨大创伤和风险，又恢复胰腺的内分泌功能，是T1DM理想的治疗手段。特别是胰岛纯化技术及新型免疫方案的发展大大的推动了其临床应用[4]。本组10例受者的移植胰岛均取自于成人DCD供者。所有供胰采用新型Liberase酶消化，COBE2991型细胞分离机及连续密度梯度方法分离与纯化胰岛细胞，均成功分离出胰岛。大多数单个胰腺就可获取25万～40万IEQ的胰岛，一般1至2个胰腺就可分离到1个受者所需的胰岛。随访3年，10例受者的胰岛移植总体治疗有效率为100%，术后12个月胰岛素撤除率为60.0%，36个月胰岛素撤除率为40.0%，36个月内胰岛素减量比例均超过60%，C肽均有明显升高。以上结果证实，DCD供胰完全可以作为胰岛移植的来源，移植后移植物的功能纠正了血糖不稳定和致命性低血糖的发作，并且明显改善了受者的多器官微血管变化，其移植物长期存活率还有待于进一步观察。这也与近期日本学者多中心的报道结果相同[5]。姚豫桐等[6,7,8]在美国工作期间首次证实单个DCD供者来源的胰岛可治愈糖尿病。我们认为，胰岛是由4种细胞(A、B、D、PP细胞)组成的微小器官(mini-organ)，因此分离胰岛(减少胰岛的物理和化学损伤)的经验和移植方案的改进仍是提高DCD来源胰岛质量和胰岛移植效果的关键。
Edmonton方案采用西罗莫司、他克莫司等无类固醇免疫抑制剂，消除皮质激素对胰岛B细胞毒性作用，不但有效防止排斥反应，且减少了药物的不良反应，极大的促进了胰岛移植的临床应用[9]。但随后Edmonton小组发现，胰岛移植5年后只有10%的受者完全脱离胰岛素，远期效果不甚满意[10]。且全球多个胰岛移植中心按Edmonton方案进行临床试验发现结果差别较大[11]。此外研究者还发现，Edmonton方案尽管采用了相对安全的免疫抑制剂，但在移植后5年时间内，50%～80%的受者胰岛移植物的功能恶化，一些免疫抑制剂对移植胰岛也具有明显的不良反应[12]，例如长期使用西罗莫司对胰岛功能及移植物有明显副作用[13]。总之Edmonton方案仍不能有效阻止受者对胰岛的排斥，从而导致移植物功能随时间降低或丧失，改良免疫抑制剂方案已成为促进胰岛发挥长期功能的关键所在。学者们发现一些免疫抑制剂可通过自身反应性CD8＋T淋巴细胞引起胰岛移植长期功能的丧失，而ATG可通过对抗这种术后自身免疫反应从而延长胰岛的长期功能[14,15]。Bellin等[16]通过联合使用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和依那西普(TNF-α拮抗剂)，在免疫诱导治疗中取得了较大成功。美国国立卫生研究院(NIH)和食品及药物管理局(FDA)领导的临床胰岛移植协会也建议对Edmonton方案进行改进，其中包括使用多克隆抗胸腺细胞球蛋白ATG、TNF-α拮抗剂进行免疫抑制诱导以及采用不含糖皮质激素的免疫抑制维持方案[17]。我中心在Edmonton方案基础上，联合采用ATG-F和依那西普的免疫诱导方案，他克莫司＋吗替麦考酚酯作为免疫抑制维持方案，减少了药物总用量，并控制血药浓度在治疗窗内，避免血药浓度过高所致对胰岛的药物毒性。临床结果显示，10例受者均未出现免疫抑制剂的不良反应，术后36个月胰岛素撤除率40.0%，胰岛素减量比例均超过60%，取得了近期的良好效果。当然，免疫排斥反应仍是胰岛细胞移植远期效果差的主要原因，改良免疫抑制方案来诱导免疫耐受或者采用免疫隔离方案如胰岛微囊化技术来屏蔽胰岛细胞抗原的表达可能是努力的方向[18,19]。
目前，供者胰腺的短缺和移植胰岛较低的长期存活率是影响胰岛移植广泛开展的两大影响因素[20,21]。我中心采用DCD供者胰腺，建立专业的药品生产质量管理标准(GMP)实验室和移植团队，制订统一的、适合国情的技术和质量标准，以期取得较满意的长期效果。而本组病例更远期的临床效果以及对糖尿病并发症的防治等，还有待于长期的随访观察。
编后 临床同种异体胰岛移植已成为治疗1型糖尿病的一种有效方法。随着Edmonton方案的推广应用，临床胰岛移植的短期效果也有了显著的提高。然而，移植胰岛的长期存活仍然不尽人意，而且胰岛移植后早期所面临的即时血液介导炎症反应(IBMIR)也是制约临床胰岛移植发展的重要因素。四川省人民医院姚豫桐等成功分离出高纯度及高活性的胰岛细胞，并对10例1型糖尿病患者施行同种异体胰岛移植，术后采用一种改良的Edmonton免疫抑制方案，随访3年内获得令人鼓舞的治疗效果，6例(60%)完全撤除胰岛素治疗。相信在未来技术不断改进、经验不断积累的基础上，临床胰岛移植能够成为1型糖尿病的理想治疗方法。
