探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)中的作用及临床意义。
选择2013年6月到2016年4月接受异基因造血干细胞移植的65例受者，收集移植后15、30、60、90 d以及当受者发生aGVHD时的外周血样本，同时收集10例正常志愿者外周血样本作为正常对照，采用实时荧光定量聚合酶链反应法定量检测PPARγ、γ干扰素(IFN-γ)及T-bet mRNA的表达水平，分析PPARγ表达水平与aGVHD及TH1细胞因子IFN-γ和T-bet表达的相关性。在体外进行淋巴细胞混合实验，采用CCK8试剂盒检测PPARγ激动剂罗格列酮对淋巴细胞增殖的影响。
65例受者中移植后90 d内有45例发生aGVHD(aGVHD组)，20例未发生aGVHD(无aGVHD组)。正常志愿者外周血PPARγ表达量明显低于移植后90 d内的受者(P<0.05)。未发生aGVHD的受者移植后90 d内PPARγ的表达量无明显变化。aGVHD组受者PPARγ的表达量比无aGVHD组受者表达量降低(P<0.05)。发生Ⅲ～Ⅳ度aGVHD受者的PPARγ表达量显著低于发生Ⅰ～Ⅱ度aGVHD受者，二者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在aGVHD组，TH1细胞相关因子IFN-γ、T-bet的表达明显升高，且与PPARγ的表达存在负相关(P<0.05)。体外淋巴细胞混合实验显示，PPARγ激动剂罗格列酮在25 μmol/L及以上浓度对淋巴细胞增殖剂量依赖性抑制(P<0.01)。
PPARγ表达与aGVHD的发生及严重程度存在相关性，PPARγ激动剂可以抑制淋巴细胞的增殖，可能成为治疗aGVHD的新方法。
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异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前治疗恶性血液病的一种有效方法，急性移植物抗宿主效应(aGVHD)是allo-HSCT后的主要并发症之一，是影响受者移植相关死亡的关键问题[1]。在aGVHD发生过程中，T淋巴细胞活化、增殖和分泌炎症介质从而引发炎症反应是关键机制，对炎症反应的调控是治疗aGVHD的重要方向[2]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是一种配体活化的核转录因子，在脂肪细胞分化、糖脂代谢、胰岛素敏感性及免疫反应的调节等方面发挥重要作用。近年来，有研究发现，PPARγ可通过抑制核因子-κB(NF-κB)抑制淋巴细胞分泌炎症因子，在自身免疫疾病、脓毒血症等疾病中发挥抗炎作用[3,4,5]。目前，PPARγ在allo-HSCT后aGVHD中的作用研究较少，尚未有对人体PPARγ的表达与aGVHD的相关性研究。故本研究通过检测allo-HSCT受者PPARγ的表达情况，并在体外实验中进行验证，探讨PPARγ在aGVHD发病中的作用及临床意义。
选择2013年6月到2016年4月在我院接受allo-HSCT的受者65例。65例受者中，男性45例，女性20例，年龄中位数34岁(11～60岁)；无关供者HSCT 9例，同胞HLA全相合HSCT 25例，单倍体HSCT 31例；原发病为重型再生障碍性贫血(SAA)4例，骨髓增生异常综合征(MDS)10例，急性淋巴细胞性白血病(ALL)17例，急性髓性白血病(AML)26例，慢性粒细胞性白血病(CML)3例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)4例，以及夜间阵发性睡眠性血红蛋白尿征(PNH)1例。原发病为髓性白血病及部分低危ALL的受者采用改良白消安＋环磷酰胺(Bu＋Cy)的预处理方案；原发病为淋巴系统和合并中枢神经系统白血病的AML者采用全身照射(TBI)＋Cy的预处理方案；原发病为再生障碍性贫血的受者采用改良氟达拉滨＋环磷酰胺＋抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的预处理方案。
采用甲氨蝶呤＋长程环孢素A预防aGVHD。移植后第1、3、6和11天，分别应用甲氨蝶呤15、10、10和10 mg/m2；移植前第10天开始使用长程环孢素A 3 mg·kg－1·d－1；无关供者HSCT受者于移植前第5天至移植前第2天，加用ATG 2.5 mg·kg－1·d－1，移植前第7天开始加用吗替麦考酚酯30 mg·kg－1·d－1。
依据临床常用的西雅图诊断及分级标准对aGVHD进行分级诊断，一线治疗采用甲泼尼龙2 mg·kg－1·d－1，如果对皮质激素治疗反应差，加用甲氨蝶呤、抗CD25单抗等治疗。
移植后15、30、60、90 d以及当受者发生aGVHD时，采集受者外周血各4 ml，分离外周血单个核细胞，加TRIzol冻存，以同期10例正常志愿者外周血样本作为正常对照。取处理后的外周血样本，提取细胞总RNA，采用RNA逆转录试剂盒(Promega公司)进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)合成cDNA。采用美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)的SYBR Green PCR试剂盒，以肌动蛋白β(β-actin)为内参进行实时荧光定量PCR，对PPARγ、γ干扰素(IFN-γ)及T-bet mRNA表达水平进行定量检测。基因表达量由相对内参表达倍数表示，计算方法为2－ΔCT，ΔCT＝待测基因CT值－内参CT值。
取2名无关正常志愿者外周血各5 ml，用淋巴细胞分离液Ficoll分离出淋巴细胞，作为刺激细胞。将分离出的淋巴细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，其中一个样本加丝裂霉素20 μl，于37 ℃下孵育30 min，以阻断细胞周期，作为刺激细胞；另一个样本不处理，作为反应细胞。再将刺激细胞与反应细胞按1∶1的比例加入96孔板中混合，然后分别将PPARγ激动剂罗格列酮以100、50、25、12.5及0 μmol/L的浓度梯度加入其中，3 d后用CCK8试剂盒检测细胞增殖程度，结果用450 nm处的吸光度值(A值)表示，A值越高表示细胞增殖程度越高。
实验结果用Graphpad prism 5软件进行处理，两样本均数的比较采用Mann-Whitney检验，相关性用Spearman检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。
65例受者中，移植后90 d内有45例发生aGVHD(aGVHD组)，20例未发生aGVHD(无aGVHD组)。移植后90 d内各检测时点，无aGVHD组受者的PPARγ表达量均无明显变化(P<0.05，图1)。与正常对照组相比，移植后90 d内aGVHD组和无aGVHD组受者外周血PPARγ表达量均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与移植后90 d内无aGVHD组受者比较，aGVHD组受者的PPARγ表达量显著降低，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。发生Ⅲ～Ⅳ度aGVHD受者的PPARγ表达量显著低于发生Ⅰ～Ⅱ度aGVHD受者，二者比较，差异有统计学意义(P<0.05)，二者均低于无aGVHD组受者，差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。
与无aGVHD组比较，aGVHD组TH1细胞相关因子IFN-γ和T-bet的表达水平均明显升高，两组比较，差异均有显著统计学意义(P<0.01，图4、图5)。将PPARγ表达量分别与IFNγ和T-bet表达量进行相关性分析，结果显示，相关系数分别为－0.3114(P<0.05)和－0.2997(P<0.05)，PPARγ的表达与IFN-γ和T-bet的表达均呈负相关。
应用CCK8试剂盒检测PPARγ激动剂罗格列酮对淋巴细胞增殖的影响，结果显示，当罗格列酮浓度为12.5 μmol/L时对淋巴细胞增殖无明显效应，当罗格列酮从浓度25 μmol/L开始，随着浓度梯度的增加，淋巴细胞增殖程度逐渐显著降低，差异均有显著统计学意义(P<0.01，图6)。
PPARγ自1990年由Issemann等[6]发现以来，被视为糖脂代谢中的重要通路，其激动剂噻唑烷二酮类作为胰岛素增敏剂已在临床应用近20年。近年来，PPARγ在免疫系统中的作用逐渐为人所了解。Clark等[7]发现T淋巴细胞受体(TCR)的激活可促使PPARγ的表达增加，而PPARγ又可反过来抑制T淋巴细胞的活化和白细胞介素2(IL-2)的分泌。随后不断发现PPARγ在T淋巴细胞等免疫细胞中发挥重要作用[5,8]，可以抑制T淋巴细胞活化产生的IFN-γ、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17等炎症因子[3,9,10]。另外有研究显示，PPARγ的缺失可提高TH1细胞与TH2细胞的比例以及TH17细胞与调节性T淋巴细胞(Treg)的比例[11,12,13]。
本研究结果显示，正常人外周血PPARγ表达量明显低于造血干细胞移植后90 d内的受者(P<0.05)，推测是因为移植后TCR的广泛刺激促使PPARγ的表达增多[9]，为机体对炎症的一种负反馈调控。未发生aGVHD的受者在移植后90 d内PPARγ的表达量无明显变化，表明在无aGVHD发生时PPARγ的表达量在移植后90 d内可保持稳定。aGVHD组受者较无aGVHD组受者的PPARγ表达量显著降低(P<0.05)，提示PPARγ表达的下调与aGVHD的发生相关，PPARγ表达不足引起抗炎作用的减弱，从而导致炎症因子风暴的爆发，从而介导aGVHD的发生。关于PPARγ下调的原因尚不清楚，可能与其上游信号通路的改变有关，而目前对PPARγ的上游信号通路的研究很少，有待进一步研究。而发生Ⅲ～Ⅳ度aGVHD受者的PPARγ表达低于发生Ⅰ～Ⅱ度aGVHD的受者，PPARγ的表达与aGVHD严重程度的相关性进一步验证了PPARγ表达越低，对aGVHD的保护作用越弱。这种PPARγ对aGVHD的保护作用与Song等[14]在小鼠上的实验结果一致。
在aGVHD发生过程中，TH1细胞的分化增殖和分泌起到了关键作用。IFN-γ是其分泌的重要炎症因子之一，T-bet是其转录因子。结果显示，在aGVHD组，TH1细胞相关因子IFN-γ和T-bet的表达均明显升高，且与PPARγ的表达均存在负相关(P<0.05)。既往的研究表明，TH 1细胞活化和分泌IFNγ等炎症因子介导aGVHD发生[15,16]，而T-bet作为TH1细胞的转录因子也与aGVHD有相关性[17]，这些结果与本研究一致。IFN-γ与T-bet的表达与PPARγ呈负相关，相关系数分别为－0.3114和－0.2997，且经相关性检验均有统计学意义，表明在aGVHD的发生中IFN-γ与T-bet的过表达和PPARγ的低表达密切相关，PPARγ可通过抑制T-bet通路和IFN-γ的表达来抑制aGVHD。以上表明，增加PPARγ的表达可能是预防和治疗aGVHD的一种新思路。
在体外实验部分，我们通过将2名正常志愿者外周血进行淋巴细胞混合实验来模拟炎症反应，验证PPARγ激动剂罗格列酮对活化后淋巴细胞的作用。结果显示，罗格列酮在25 μmol/L及以上浓度对活化后的人类淋巴细胞增殖呈剂量依赖性抑制作用，与之前在小鼠和体外细胞系中的研究结果相符[5]。结合以上实验结果，罗格列酮对PPARγ的激活可能对aGVHD有调控作用，这种作用可以通过抑制淋巴细胞的增殖、分泌等途径来实现。该药物有望成为预防和辅助治疗aGVHD的新药。由于罗格列酮不良反应相比于传统免疫抑制剂较小，主要是少数受者中有导致或加重充血性心功能衰竭的危险，而2016年国家食品药品监督管理总局将其禁忌征放宽为有心衰病史或有心衰危险因素的患者禁用[18]，因此将有更广的应用前景。
综上所述，PPARγ表达低下与aGVHD发生及严重程度存在相关性，可能对aGVHD的发生存在抑制作用，这种作用可能是通过对IFN-γ等细胞因子和T-bet等转录因子的调控以及抑制淋巴细胞的增殖来实现的。PPARγ可能成为监测和防治aGVHD的一个新靶点，其激动剂罗格列酮有望成为预防和辅助治疗aGVHD的新药。而这种作用还需要更多的体内体外实验进行验证，其机制也尚需进一步完善，这将成为下一步研究的方向。
