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移植肾纤维化(RAF)是移植肾远期存活的主要障碍，任何引起移植肾损伤的因素都能够引发一系列复杂的细胞和分子级联反应，导致组织纤维化，在损伤程度严重和(或)持续存在时，实质性瘢痕形成，并最终引起细胞功能障碍和器官功能衰竭。RAF在病理上的典型表现为肾小球硬化、肾小管间质纤维化、炎症细胞浸润以及肾实质的丢失；它是一个多细胞事件参与的过程，包括系膜细胞和成纤维细胞激活、肾小管上皮细胞表型转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)、单核细胞和T淋巴细胞的浸润以及细胞凋亡等(图1)[1]。本文就近年RAF发生机制的研究进展及抗纤维化治疗的新策略进行综述。
肾脏产生ECM的细胞有肾间质成纤维细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞等。ECM是由胶原蛋白、非胶原蛋白和蛋白聚糖构成的复杂网络结构。肾脏中最重要的胶原蛋白是I型和III型胶原蛋白(均为纤维状蛋白)以及IV型胶原蛋白(非纤维状蛋白，是基膜的主要组成成分)。非胶原类蛋白包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白、腱生蛋白等，很多研究已经证实其与很多细胞因子的过量表达有关。例如在大鼠糖尿病模型中发现腱生蛋白和层粘连蛋白的上调与转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的过度表达有关[2]。正常的生理状态下，ECM的分解和合成处于动态平衡中；病理状态下，ECM的合成增加，分解减少，ECM过度沉积，表现为结缔组织不适当地聚集，包括I型、III型、IV型胶原蛋白和各种蛋白聚糖聚集，导致正常组织结构被破坏，发生纤维化，移植肾功能逐渐丧失。
EMT是指肾小管细胞失去其上皮表型，获得间质细胞特性的过程。EMT已被证实在很多器官包括肾脏中有促纤维化的作用[3]。EMT可以概括为以下四步(图2)：(1)上皮细胞间黏附作用的丧失；(2)α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达和肌动蛋白重组；(3)肾小管基底膜(tubular basement membrane，TBM)的破坏；(4)细胞的迁移与侵袭能力的增强[4]。
在调节EMT的众多纤维化因子中，TGF-β被认为发挥核心作用。TGF-β1作为一个独立因子能够诱导EMT的整个过程；血管紧张素II (angiotensin II，Ang-II)则能通过加强与TGF-β1有关的α-SMA表达，从而促进EMT，但其本身不能直接诱导α-SMA的表达；基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和MMP-9主要作用于肾小管基膜的层粘连蛋白和IV型胶原蛋白，破坏基膜的完整性。故可以通过阻断EMT关键事件的发生来干预RAF的进程。例如，肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP-7)能够拮抗TGF-β1，抑制EMT(第1步)；Ang-II受体拮抗剂氯沙坦能抑制其活性，减弱RAF(第2步)；在患有梗阻性肾病的小鼠中选择性阻断EMT，使MMP-9的表达减少，保护TBM的完整性(第3步)；此外，Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)抑制剂可抑制细胞迁移，减慢肾脏纤维化的进程[4](第4步，Rho相关蛋白是一种三磷酸鸟苷结合蛋白；ROCK是最早发现的Rho相关蛋白效应物，是具有信息传导和分子开关功能的信号多肽，可直接参与肌动蛋白细胞骨架的组建、细胞黏附及细胞迁移的调节)。
TGF-β是一个很重要的促纤维化因子，可通过Smads和非Smads信号通路诱导下游因子表达而产生促纤维化效应，被认为是肾脏纤维化的中心因子。研究表明，TGF-β主要通过以下途径发挥作用：(1)刺激细胞外基质蛋白质产生；(2)促进蛋白酶抑制剂的产生；(3)上调整联蛋白的表达；(4)抑制细胞外基质水解酶的活性[5]。此外，TGF-β对自身的合成有正反馈调节作用，能进一步增强其促纤维化作用。
CTGF作为TGF-β的下游信号因子，执行促纤维化作用[6]。体外研究证实多种肾脏细胞都能产生CTGF。研究发现，发生纤维化的肾脏中CCN2(一种CTGF)表达上调；在小鼠单侧输尿管结扎模型中，CCN2抑制剂能够显著减少肾脏纤维化；CCN2能够介导晚期糖化终产物的促纤维化作用，这些都是CTGF发挥促纤维化作用的有利证据[7,8,9]。CTGF的促纤维化作用与TGF-β相似，但CTGF不具有免疫调制的作用。CTGF与TGF-β1起协同作用，能下调成纤维细胞，产生MMP-2，介导系膜细胞产生胶原蛋白，使ECM过度沉积，促进EMT进程，导致促纤维化效应[10]。
HIF系统在与血红素加氧酶-1有关的急性缺血损伤中起到保护作用，而在其他的HIF靶基因如基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1，TIMP-1)、CTGF等则起到促纤维化作用[11]。研究表明长期缺氧是肾间质纤维化的作用机制之一，可导致细胞生成HIF-1α增多，HIF-1α通过激活体内缺氧性基因的表达，促使肾小管萎缩和间质纤维化[12]。TGF-β1可通过Smad蛋白依赖性途径降低脯氨酰羟化酶-2的产生，导致HIF-1α积累[13]。此外，研究还发现缺氧时，肾组织中成纤维细胞大量增殖，还出现肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞的现象，这也提示HIF-1α可能在缺氧诱导的肾间质纤维化过程中起着重要作用[14]。
PDGF是正常肾发育所必需的，它持续性或诱导性地表达于肾脏间充质细胞中，并将间充质细胞聚集到肾小球和间质。在损伤时，其还在上皮细胞和浸润细胞中表达。研究发现，抑制PDGF的表达能减缓肾纤维化，起到保护肾脏的作用。PDGF对携带PDGF受体的间充质细胞发挥自分泌和旁分泌作用，介导间充质细胞的增殖、迁移和激活[15]，在肾间质纤维化、系膜增生改变和肾小球血管生成中发挥重要作用。其中二聚体PDGF-BB和DD通过直接诱导作用在肾小管间质瘢痕形成和肾小球硬化的进程中影响系膜细胞的增殖和激活；PDGF-CC可强烈刺激间质成纤维细胞到肌成纤维细胞的增殖，且伴随ECM沉积、小管间质瘢痕的形成。同时PDGF也可通过间接致纤维化作用刺激TGF-β、CTGF等下游因子的表达，间接促使细胞增生，ECM积聚并抑制基质的降解[16]。
ET-1表达增加可使血管长时间收缩，导致组织缺血缺氧，促进肾脏纤维化[17]。研究表明ET-1可通过以下途径发挥作用：(1)刺激趋化因子和细胞因子自分泌信号循环促进ECM胶原蛋白的积累，促进纤维化[18]；(2)促进肾间质成纤维细胞的增殖和其内与I型胶原蛋白相关基因的表达；(3)上调肾间质成纤维细胞中TGF-β mRNA的表达；(4)明显上调肾间质成纤维细胞中TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达[19]。
Ang-II可通过血液动力学及非血液动力学发挥促纤维化作用。Ang-II增加能够刺激血管平滑肌细胞产生更多的TGF-β，刺激系膜细胞，增加ECM沉积。Ang-II还可以促进HIF-1α在肾小管上皮细胞中的表达[20]。
MMPs主要有2个方面的功能：(1)几乎能降解全部ECM成分；(2)能激活其他MMP，形成级联效应。因此，MMP在肾脏纤维化中发挥重要作用。TIMP与MMP产生于同一细胞，是调节MMP活性的主要物质。正常情况下，MMP/TIMP处于平衡状态，相互调控；病理情况下，MMP/TIMP发生失控，引起ECM沉积，促进器官纤维化。此外，有研究结果表明MMP-2和MMP-9能够直接在体内诱导EMT的整个过程[21,22]。MMP-2和MMP-9主要作用于肾小管基膜的层粘连蛋白和IV型胶原，破坏基膜的完整性，这是完整诱导EMT不可缺少的一步，它使新转化的间充质细胞能迁移和侵袭肾间质，促进EMT[4]。
肾脏能大量表达HGF及其受体。HGF能通过抑制TGF-β1的表达、肌成纤维细胞的活化以及EMT来阻止慢性肾纤维化的进展，是一个强效抗纤维化因子，且已作为一种治疗肾脏慢性疾病的抗纤维化剂[13,23]。有实验对患有慢性移植肾肾病的大鼠用重组HGF进行4周治疗，发现HGF可防止早期移植肾损伤；而且，HGF可与Ang-II拮抗剂相互协同抗纤维化[24,25]。
移植肾在术中及术后受损导致单核细胞进入肾组织，纤维母细胞增生，ECM重分布，启动修复机制，最终形成瘢痕组织并导致纤维化。研究表明炎症细胞在移植肾损伤中扮演了重要角色。不同的白细胞亚群能够促进RAF，尤其是专职吞噬细胞和抗原提呈细胞；这些细胞表现出显著的可塑性和功能重叠，可根据其表型和所处的病理环境发挥抗纤维化或促纤维化作用[10]。巨噬细胞浸润是RAF一种常见的病理改变。巨噬细胞能促进ECM内容物的形成，并能通过分泌成纤维细胞生长因子-2、TGF-β1、CTGF等因子诱导RAF的主要效应细胞成纤维细胞增殖活化并刺激其转化为肌纤维母细胞，促进RAF[31,32]。新近研究表明，肌纤维母细胞不仅能够合成ECM并造成其病理沉积，而且是一种重要的炎症细胞，能够释放趋化因子、炎症因子和有毒的氧自由基，因而是肾脏损伤后瘢痕形成与纤维化的关键细胞[33]。T淋巴细胞在肾脏纤维化中的作用尚不明确，但初步研究提示其可能参与了实验中小鼠的纤维化过程[34]。肥大细胞与ECM合成以及纤维化瘢痕组织的形成密切相关[35]，实验表明肥大细胞能分泌多种促进肾脏损伤的因子，它们能够促进肾脏成纤维细胞的增殖和胶原的形成，并在组织纤维化过程中发挥重要作用[36]。
免疫抑制剂的毒性作用能够促进移植肾慢性功能减退，尽管其作用目标是参与免疫应答的细胞，但是对上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞均具有毒性作用[37]。如钙调磷酸酶抑制剂(CNI)具有急性肾毒性，这主要缘于血液动力学改变(入球小动脉的血管收缩)和可逆的肾小管功能障碍。而长期应用CNI会导致肾脏结构不可逆损伤，引起微血管和肾小球损伤，动脉玻璃样沉积，肾小管萎缩和肾间质纤维化[38]。其次，CNI可通过非血液动力学因素间接介导肾毒性，如刺激活性氧的产生、激活慢性肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)导致促纤维化的作用，诱导EMT类改变并刺激TGF-β的生成[39]。相比之下，很多研究发现mTOR抑制剂如西罗莫司，其作为一种新型免疫抑制剂，可以通过影响PDGF、TGF-β、Ang-II、BMP-7等促/抑纤维化因子改善移植肾纤维化[40,41]。在以慢性移植肾肾病大鼠为模型的研究中比较西罗莫司和环孢素A对CTGF等因子表达的影响中发现，西罗莫司能通过抑制EMT过程，减少CTGF的表达，从而减缓移植肾纤维化，而环孢素A没有这个作用[42]。
随着对肾脏纤维化发生机制的认识不断深入，越来越多的分子靶向治疗已经在临床前模型中显现出了一定的发展前景。现将肾病治疗中新型的纤维化干预方案归纳如下(图3)[43,44]。
大量的动物研究证实通过中和抗体、反义寡脱氧核苷酸、可溶性受体或TGF-β激酶的特异性抑制剂来抑制TGF-β途径后，纤维化程度减轻，肾功能得到改善[44]。在临床研究中测试抗TGF-β中和抗体Fresolimumab，发现其在局灶节段性肾小球硬化患者中，具有肾脏保护作用。
在许多纤维化疾病模型中，吡非尼酮(prifenidone)可以抑制TGF-β的表达和基质沉积。在局灶节段性肾小球硬化患者的Ⅱ期研究中显示Prifenidone对血压或蛋白尿无影响，但eGFR下降减缓了25%[43]。在正在进行的糖尿病肾病患者Ⅲ期安慰剂对照实验研究中发现，Prifenidone组1年后eGFR改善(仅1200 mg/d组)，相比之下安慰剂组eGFR降低，但蛋白尿无差异[43]。
CTGF受TGF-β调控，是直接促纤维化因子。在动物模型中发现通过小干扰RNA、中和抗体或遗传缺失来抑制CTGF可以显著降低肾纤维化[44]。在糖尿病肾病患者中测试抗CTGF抗体FG-3019，发现尿微量白蛋白减轻。目前，FG-3019的临床测试重点已经向肝纤维化、肺纤维化、胰腺癌等转移[44]。
另一种直接减少纤维化的方法是调节细胞和ECM之间的平行作用。在纤维化过程中ECM的重塑是通过细胞基质受体(如α5β6整合素)影响固有和浸润的细胞，局限性活化TGF-β[44]。成纤维细胞中的遗传缺失或阻断α5β6的药物减少了肾脏纤维化。半乳糖凝集素-3(Galectin-3)在远端小管和集合管的α-闰细胞中表达，在肾纤维化中表达上调。在大多数临床前研究中，发现其抑制Galectin-3可以减少肾纤维化[44]。
然而，将特定的抗纤维化干预措施应用到临床是极具挑战性和不确定性的，可能原因如下：(1)许多促纤维化分子也参与器官的某些生理功能并具有重要作用。在某些情况下，不良反应难以规避。如TGF-β具有抗炎和抗肿瘤作用，但长期抑制TGF-β可能加剧或甚至诱导自身免疫应答[44]。(2)TGF-β的下游介质如CTGF和酪氨酸激酶配体促纤维化相关通路较多，平行阻断多种促纤维化通路可能效果更加显著，但也许会增加不良反应的发生[43]。(3)在任何纤维化疾病中都存在一个关键问题：潜在的上皮损伤和炎症持续存在时，阻止不良组织修复机制和抑制基质过度沉积对患者的获益程度尚不明确，因为很多因素(如CNI，Ang-II，高血糖)能直接刺激TGF-β，并且它们可能对该通路的特异性靶向作用产生影响[43]。
RAF是一个由多细胞和多分子参与、相互作用的动态过程，免疫抑制剂对其也有一定作用，故机制非常复杂。虽然近年来对RAF的机制有了很多新的认识，但仍未能对其作出确切的解释。因此，对RAF机制的进一步探讨以及改善纤维化策略的临床应用仍是将来的研究重点，这对提高移植肾远期存活具有重大的意义。
