器官移植后排斥反应和后续免疫抑制剂的长期服用及其副作用是受者无法避免的重要问题。因此，针对排斥或耐受状态的免疫学精准监测是指导免疫抑制剂及时减量甚至撤销，最终诱导操作性免疫耐受的重要依据，也是当前精准医疗与个体化医疗时代所面临的重要挑战。本文系统综述了当前器官移植术后针对异体抗原的免疫应答监测指标的现状及未来发展方向。
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如何在器官移植术后精准地监测移植受者针对供者器官的免疫耐受/排斥状态，从而准确指导免疫抑制剂的用量，是当前个体化医疗时代下移植免疫领域所面临的重要挑战。传统经典的检测方法大多依赖移植器官的功能指标和组织活检，其具有预示滞后性和检测创伤性。因此，针对移植供者的免疫学监测指标或生物标志物一直是移植免疫领域的研究热点。
人同种异体器官移植排斥反应的发生主要基于HLA系统的多态性同种抗原，该系统是人体最复杂的多态系统之一。供者HLA抗原经移植受者的抗原提呈细胞(APC)加工呈递给受者T细胞，导致受者T细胞活化分泌细胞因子进一步加强固有免疫应答，同时刺激CD4 T细胞和CD8 T细胞表达颗粒酶和穿孔素等攻击供者抗原。此外，在此过程产生的针对供者抗原的记忆性T细胞更成为移植耐受诱导中的主要障碍[1]。除去细胞免疫介导的急性排斥反应外，移植受者针对供者抗原产生的特异性抗体介导的体液免疫也是引发超急性和慢性排斥反应的主要因素。特异性抗体与供者抗原的复合物还会激活补体系统，从而通过补体活化途径杀伤靶细胞，攻击移植物。
此外，除效应性T细胞和B细胞介导的排斥反应外，另一部分免疫细胞在建立移植免疫耐受过程中也起重要作用。调节性T细胞(Treg细胞)是CD4 T细胞中一个特殊的亚群，其表达CD25和FoxP3等特异性标志物，约占外周血CD4 T细胞的5 %，它通过多种机制有效抑制效应性T细胞(Teff细胞)活化和增殖，在维持免疫稳态和移植耐受中有重要作用[2]。调节性B细胞(Breg细胞)是B细胞中的一个特殊亚群，其主要通过白细胞介素10等在自体免疫疾病和肾移植免疫耐受中起重要作用[3]。
基于实体器官移植排斥反应和免疫耐受发生过程中的各个靶点，已有覆盖大部分靶点的免疫学监测指标及方法。
检测T细胞针对供者抗原的免疫应答有经典的单项混合淋巴细胞反应(MLR)，其主要用于移植术前检测移植受者针对供者失活细胞刺激条件下的淋巴细胞增殖情况，从而判断二者HLA抗原差异程度，该方法耗时较长(4～5 d)，重复性较差。酶联免疫斑点实验(ELISPOT)是一种在单个细胞水平检测受者T细胞针对供者抗原刺激分泌IFNγ能力的非常敏感的检测方法。该方法使用受者细胞与失活的供者细胞共培养，培养板表面事先用IFNγ捕捉抗体包被，一旦受者细胞经供者抗原刺激产生IFNγ即被培养板表面的抗体捕获，经过显色后即成为一个点。因此，每一个点代表一个该刺激条件下分泌IFNγ的细胞，即抗原特异性T细胞。Hricik等利用该方法检测了53例肾移植术后1年受者外周血中的供者特异性T细胞反应，结果发现，在移植肾组织活检结果证实排斥反应的受者中同时也有增加的ELISPOT斑点数量，斑点大小及斑点强度。另外，在16例发生急性排斥反应的受者中，14例都显示出ELISPOT阳性结果，而只有1例呈现升高的群体反应性抗体。该结果强烈提示供者特异性ELISPOT检测相对群体反应性抗体具有更高的排斥反应预测价值[4]。HLA-tetramer技术是使用已知供者HLA信息的HLA抗体结合流式细胞术检测含有HLA特异性TCR的T细胞，该技术敏感度高，但需要合成整个供者HLA库，成本较高，现有抗体不能完全模拟实际的供者抗原信息[5]。
此外，ImmunKnowⒸ也叫Cylex测试，是一项经FDA批准的检测CD4T细胞经丝裂霉素刺激后产生ATP的一种检测方法[6]。其中所检测的ATP含量低于224 ng/ml时，提示免疫抑制过度，224～524 ng/ml提示合适的免疫抑制程度，当ATP含量高于524 ng/ml时提示免疫抑制不足。Myslik等[7]发现肾移植术前ATP的值与预测移植排斥的相关性比移植后ATP值与其的相关性更高。也有同行发现，当ATP水平低于130 ng/ml或高于450 ng/ml时，均提示排斥反应的高风险性[8]。但这些数据需要更多的临床试验和数据来支撑和加强。
基于Treg细胞强大的免疫抑制功能，已有多项研究表明，Treg细胞水平与多种自身免疫性疾病或感染相关，也有学者将Treg细胞/Th17细胞比例作为预示器官移植后排斥状态的指标[9]。但基于Treg细胞总量的检测指标，只能反映移植受者整体的免疫抑制状况，无法区分其是否是针对供者抗原还是外源病菌，因此Treg细胞总量不能理想地反映移植物耐受情况。但我们前期的试验表明，记忆型Treg细胞在肾移植后受者的操作性免疫耐受中起重要作用[10,11]。因此，记忆型Treg细胞相比Treg细胞总量也许可以更好地反映移植物耐受状态。
受者CD154＋细胞毒性T细胞是近年来排斥反应无创检测研究中新发现的生物标志物，检测该指标的试验方法被称为PleximarkTx试验，目前该方法已被FDA通过，正在美国匹兹堡Plexision公司进行。研究者使用受者淋巴细胞和供者淋巴细胞体外培养，利用流式细胞术检测受者CD154＋记忆型细胞毒性T细胞，该结果可以用来预测移植术后排斥反应发生的可能性。目前，在肾移植后的临床试验中，该方法具有88 %的敏感性和86 %的特异性。异体抗原特异性CD154＋记忆型细胞毒性T细胞应答与急性细胞介导的排斥反应严重性相关，在排斥风险相对较低的受者中可以用作减少组织活检的有效手段[12]。然而，该方法仍需要更多研究中心提供的数据支持和优化。基于T细胞免疫应答检测指标和方法的优缺点总结见表1。
器官移植后T细胞免疫应答检测指标及方法
器官移植后T细胞免疫应答检测指标及方法
| 检测方法 | 方法描述 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 单向混合淋巴细胞反应(MLR) | 经典技术，术前用失活的供者细胞刺激染料标记的受者细胞，二者共培养，观察受者细胞增殖情况 | 成本低，易操作 | 重复性差，耗时长(4～5 d) |
| 异体抗原特异性T细胞反应(ELISPOT)[4] | 受者细胞与失活的供者细胞共培养，培养孔板事先用细胞因子抗体包被，用以检测该刺激条件下分泌细胞因子的细胞。 | 重复性好，较敏感 | 需要供者细胞，在公民逝世后器官捐献(DCD)的移植中应用受限；操作时间相对较长(24～36 h) |
| HLA-tetramer技术定量抗原特异性T细胞 | 用已知HLA分型的抗体结合流式细胞术检测HLA特异性T细胞 | 容易检测带有HLA特异性TCR的T细胞 | 现有HLA抗体有限，无法模拟完整HLA库 |
| ImmunKnow®[7,8] | 检测受者T细胞针对供者抗原刺激时胞内ATP合成 | 可反应受者T细胞针对特定抗原的活化状态 | 与预测移植排斥的相关性还需要更多临床数据的支撑；无法得知其供者抗原特异性 |
| 外周调节性T细胞总量 | 利用流式细胞术检测外周血中Treg含量 | 操作相对简单，样品易于获得 | 无法得知Treg针对供者抗原的特异性，同时提示感染风险 |
| 检测CD154受者细胞毒性T细胞[12] | 利用流式细胞术检测外周血中针对供者抗原刺激的CD154＋细胞毒性T细胞 | 个体化监测 | 需要供者细胞，在公民逝世后器官捐献(DCD)的移植中应用受限； |
对于抗体介导的排斥反应(AMR)的诊断需要检测循环的供者特异性抗体(DSA)，以及利用C4d阳性或中等的微血管炎症反应的抗体与血管内皮的相互作用[13]。预先存在的供者特异性抗体可以成为急性AMR的早期标志物，然而，这还与预存DSA的诸多信息相关，如其亚型特征(IgM/IgG)、HLA特异性、抗原特异性、强度、IgG亚型及补体结合能力[14]。因此，检测B细胞针对供者抗原的免疫应答主要是检测HLA特异性抗体(也包括非HLA抗体)和分泌抗体的特异性B细胞。前者在很大程度上提高了人们对体液免疫应答在移植排斥中的作用的认识。现有的移植术后DSA监测已被移植学会广泛推荐应用于肾移植后高风险受者中[15]。然而，仅针对HLA特异性抗体的检测低估了整个体液免疫应答的水平，因为它并没有将可长期存活的可以产生特异性抗体的浆细胞(LLPC)和记忆型B细胞包括在内。浆细胞主要存在于骨髓并持续性分泌抗体，加速清除病菌并且负责维持血清中的抗体水平；而记忆型B细胞主要存在于外周淋巴组织，当再次遇见致敏抗原后可分化为抗体分泌型细胞，放大抗体效应并且补充浆细胞库，以维持没有病原菌存在情况下的抗体水平[16,17]。因此，针对记忆型B细胞，同样可以使用ELISPOT和流式细胞术。其检测原理类似ELISPOT的T细胞检测，只是把包被孔板的IFNγ换成IgG。该方法可以定量供者HLA特异性记忆型B细胞，该指标也与肾移植术后AMR紧密相关[18,19]。HLA-tetramer技术是利用已知HLA分型的抗体结合流式细胞术检测HLA特异性B细胞，但需要合成所有的HLA分子来评估整个HLA库(表2)。
器官移植术中B细胞免疫应答检测指标及方法
DSA介导的排斥反应的发生大多基于抗原抗体复合物介导的补体系统的活化。但有些DSA也可因抗体依赖的细胞毒作用或直接的内皮细胞增殖造成移植物损伤[20]。之前，将DSA和C4 d沉积一并作为AMR的诊断指标[21]，然而，Loupy等[22]发现C4 d沉积在近50 %经组织活检证实的AMR受者中是缺失的，因此，直接评估抗HLA抗体与补体组分C4 d和C3 d的结合能力成为当前的研究热点。另外，利用C1q结合试验检测DSA与补体结合能力与移植术后AMR的发生和移植物缺失的高风险正相关[23]。C1q结合表达在Ⅰ类和Ⅱ类DSA上而C3 d结合被报道主要是Ⅱ类DSA的特性[24]。在AMR受者中，相比C1q阳性DSA，DSA与C3 d的结合能力与更高DSA平均荧光强度，更差的肾小球滤过率和更高的移植物丧失风险相关；甚至具有较低平均荧光强度的C3 d阳性DSA也具有高的移植物丧失风险[25]。因此，C3 d结合试验在AMR诊断过程中可以帮助受者评估其移植物丧失的风险。此外，补体C3基因中单核苷酸多态性(SNPs)中的rs10411506和rs2230205与肾移植后的AMR也相关[26]。
炎症因子TNF-α，IFN-γ等被广泛用于炎症水平总体状况的评估，但在器官移植中缺乏供者抗原特异性。这些炎症因子基因的SNPs也被报道与移植排斥相关[27]。在一项系统性综述中，作者们在969例肾移植受者中利用多种变量分析法分析了被报道与急性排斥反应相关的23个基因变量，只有两个SNP即rs6025和rs11706052存在显著相关性[28]。因此，该指标应用于临床的一个主要不足是缺乏进一步的有效性研究。
近年新兴出现的dd-cfDNA在心脏移植的临床试验中被发现，与基于组织活检诊断的急性排斥反应紧密相关，dd-cfDNA有望成为新型非介入性移植排斥检测指标，更多相关研究仍在进行中[29]。美国加利福尼亚CareDx公司用来检测移植受者dd-cfDNA的方法叫做AlloSure检测，该方法已被用在肾移植术后2周以上的受者中，用于在该临床试验中诊断急性排斥反应[30]。该方法定量检测的前提涉及排斥损伤，包括异体移植物中的死亡细胞的增加，从而导致dd-cfDNA被释放到血流中。当dd-cfDNA低于1 %时提示没有活跃的排斥反应。当该数值高于1 %时则提示活跃排斥反应的可能(阳性预测值PPV：61 %，阴性预测值NPV：84 %)。因此，dd-cfDNA可以把AMR从非AMR中区分出来(ROC-AUC 0.87，NPV 96 %，PPV 44 %，cutoff 1 % dd-cfDNA)。目前，dd-cfDNA的系列监测虽已被推荐，但是最佳的时间间隔点以及有效性仍然有待研究。
另外，最新的一项研究显示，供者器官中存在的循环的胞外线粒体可能通过直接激活同种异体内皮细胞来加剧移植物排斥反应[31]。多个microRNA也被发现与肝移植后急性排斥反应密切相关[32]。Matz等[33]定量检测了外周血中miRNA发现对miR-15B，miR-16，miR-103A，miR-106A及miR-107的检测可以提高对重度T细胞介导的血管排斥反应诊断的敏感性和特异性。另外，肾移植受者尿液中的miRNA也与排斥反应相关[34]。但相关临床研究还需更精确。
α-1微球蛋白(α-1MG)和结合珠蛋白(Hp)被报道可以用作急性排斥反应的早期诊断指标。Stubendorff等利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)分析了116例肾移植受者尿液中的蛋白质特性，发现其可以在排斥反应初期将急性排斥反应从功能稳定的移植受者中区分出来，该方法具有73 %的敏感性和88 %的特异性。α-1微球蛋白和结合珠蛋白被推测为急性排斥反应的生物标志物，二者联合使用可使早期排斥反应诊断的敏感性提高至85 %，特异性提高至80 %[35]。
综上所述，针对器官移植排斥或耐受状态的免疫学监测是指导免疫抑制剂及时减量甚至撤销，最终诱导操作性免疫耐受的重要依据，是当前精准医疗与个体化医疗时代所面临的重要挑战。针对供者抗原的特异性免疫学检测指标是移植术后监测诊断的最理想状态，也是未来器官移植术后监测诊断的重要发展方向。随着新兴供者抗原特异性标志物的不断出现，未来，多个生物标志物的联合使用将能更好地反映器官移植术后受者的免疫耐受状态，从而更好地指导临床免疫抑制剂的合理和个体化使用。
所有作者均声明不存在利益冲突
