肾移植是治疗终末期肾病的最佳选择。为弥补供者器官的短缺，扩大标准供者供肾的使用比例，明显影响肾移植的近期和远期疗效，CO2、H2S等治疗性气体、基因、干细胞和纳米颗粒在修复损伤、抗炎以及治疗免疫排斥等方面的优势受到关注。但是全身给药后到达靶器官的能力差，疗效不佳，在目前广泛使用的低温器官保存条件下难以实施以及无法评估治疗效果等问题限制了上述治疗的应用。常温机械灌注(NMP)技术为这些问题提供可行的解决平台，为修复供肾损伤提供了新途径。本文综述了NMP作为治疗平台的最新基础研究进展。
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为弥补标准供者(SCD)器官的短缺，扩大标准供者(ECD)器官的使用日趋增多。与SCD相比，ECD常常存在预存病变，器官缺血再灌注损伤(IRI)更严重，导致肾移植术后移植肾功能恢复延迟(DGF)和急性排斥反应发生率增高，移植物的近期和远期功能及存活率明显降低。一些具有潜在价值的疗法，例如药物载体、基因和干细胞，面临着被存在于肝脏、脾脏和淋巴结中的单核和巨噬细胞组成的单核吞噬细胞系统(MPS)从循环中去除，限制了全身给药的有效性，副作用较大，以及不易直接作用供肾等问题[1]。NMP是一种利用体外膜肺氧合在接近体温状态下离体修复肾脏的技术。研究表明NMP不仅可以避免或限制冷缺血性损伤，而且能通过检测氧耗和肌酐清除率和等指标监测和评估肾脏质量，在一定范围内减轻IRI的严重程度，减少DGF的发生[2,3,4]。此外，NMP还可以作为治疗平台，在灌注系统中添加具有治疗作用的基因和干细胞，这些"药物"不受MPS的影响，通过循环直接递送到孤立的供肾，在肾脏内发挥修复作用，同时避免药物对全身的副作用。NMP作为治疗平台近年取得较大的进展[1,5]。
CO、H2S、NO等气体可以通过抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡和促进血管扩张等机制，从而减轻IRI，但由于存在全身给药剂量不易控制、细胞毒性及伦理等问题，临床转化工作受到限制[6]。通过对猪肾移植术后第1～5天的血肌酐及术后第1～3天的尿蛋白/血肌酐比值等指标的监测，CO和H2S在NMP条件下显示出抑制IRI的功效[1,7]。CO释放分子(CORM)是过渡金属羰基化合物，CORM-3、CORM-401等均属于CORM家族[8]。早期，Hosgood和Bagul团队在NMP的条件下研究了CO和NO对肾脏IRI的影响，分别利用硝普钠和CORM-3提供外源性NO和CO，以心脏停搏10 min猪的肾为对象，静态冷保存(SCS)16 h后行2 h的NMP，与空白对照组和iCORM-3组相比，硝普钠组和CORM-3组肾脏血流量显著增加，肾阻力下降更快。再灌注3 h后，硝普钠组和CORM-3组血肌酐水平明显低于iCORM-3组。与对照组相比，CORM-3组的肾血流量升高，硝普钠组的肾阻力低[9]。虽然有研究证实，这些气体在低温条件下的治疗潜力，但是真正在低温条件实施，其作用极为有限。Hosgood等的临床前实验中表明，CO和NO在NMP期间有明显的血管舒张作用，利用NMP可以为气体治疗提供一个较好的平台。虽然文章中提出CO和NO通过减轻内皮损伤和微血管功能障碍保护肾脏，但是NO保护作用相对CO较差，在组织学评估、治疗计量和时间方面仍然存在争议。
随后在2018年，Rabindra等[8]选用含锰的第四代CORM即CORM-401提供外源性CO，并通过实验表明CORM-401溶于溶液后，其释放CO的能力受温度影响，在37 ℃时CORM-401释放CO的浓度约是4 ℃的15倍。同时，该团队证实在肾组织中Toll样受体2(TLR2)和TLR6等多种TLR高表达。热缺血1 h的猪肾经NMP再灌注10 h，CORM-401组尿蛋白和肾小管坏死(ATN)减少，尿中肾脏损伤标志物如肾脏损伤分子1(KIM1)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平降低，并且显著抑制TLR2和TLR6等多种TLR以及相关蛋白高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、髓样分化因子(MyD88)和核因子-κB(NF-κB)的表达。CO保护作用的研究不断进步。
在NMP中，与CO相比，对H2S的研究较少。Nicholson团队以0.5 mmol/L的硫化钠溶液提供外源性H2S，直接注入灌注储液池，观察热缺血25 min的猪肾经3 h NMP后的效果，与对照组相比，用H2S处理后肾阻力降低，肾血流量升高。再灌注时肌酐清除率升高，血肌酐降低[10]。这项研究为H2S在肾脏IRI中的保护作用提供了证据，在离体NHBD模型再灌注时用H2S可以有效减少肾功能障碍。有研究发现，经含有惰性气体(例如氩气)的冷保存液处理后，供肾功能有所改善。最近，Stephanie等[11]的结果表明，这种保护潜力在NMP条件下存在异议。但是该团队仅探究了70%氩气1 h的NMP对肾脏的保护作用，改变气体含量和延长NMP时间后的结果仍需要探索。
间充质干细胞(MSC)是一类能够自我更新和多向分化的细胞，可以适应微环境并分化成不同的谱系，具有局部释放调节细胞因子，迁移至损伤部位调节组织再生、抗炎以及修复的能力。虽然MSC多以其调节组织修复和再生的分化特性受到关注，但是其免疫调节和旁分泌特性，例如抗细胞凋亡和抗纤维化的作用，使它们在移植领域更具有吸引力[12]。多项临床前研究表明，给予外源性MSC可通过一系列复杂机制促进肾脏修复，减少肾损伤[1,13,14]。虽然MSC具有许多优势，但是仍然面临着全身用药后难以定向递送至特定器官的缺陷，例如在啮齿动物模型中，静脉输注MSC后定植于肺部，而无法迁移到肾脏。NMP可以直接递送MSC至肾脏，并且可能实现以较少的细胞数量达到更好的疗效[15]。NMP与MSC结合的研究在肝脏和肺脏领域已有报道，但是在肾脏方面的研究很少。早期有临床前研究表明，MSC结合NMP后可以改善猪肾移植后的移植肾功能，减少肾小管损伤，并延长移植肾的存活时间[3]。随后，肾脏NMP和MSC结合的优势受到关注。2018年，国外建立了研究MSC结合NMP进行移植前治疗的联盟(MePEP)来探索这种新的治疗方式，以猪肾为对象，尝试在移植前修复肾脏以及降低移植后的免疫反应，为后续临床供肾的应用做准备[15]。MePEP着重于NMP结合MSC的临床前研究，但是尚未探究NMP是否会对MSC功能以及活性产生影响。同时，不同物种的研究结果可能存在差异，因此，动物肾模型向临床转化的可行性以及安全性仍有待探究。
基因疗法可以阻断IRI的转录机制或刺激保护通路治疗肾移植急性、慢性排斥反应和IRI。目前可选的载体有病毒、非病毒以及细胞。虽然腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等病毒载体有较好的选择，但是其毒性和刺激机体产生免疫反应的特点使其应用受到限制[16]。NMP期间的基因治疗可以避免这些问题。有研究者将定向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的小干扰RNA(siRNA)加入灌注液以及保存液中，从肾动脉直接输送到热缺血10 min的猪肾，发现肾皮质中的凋亡细胞以及炎症细胞减少，NMP时肾血流量增加[17]。该研究表明，NMP具有为基因治疗的实施与评估提供平台的潜力。但是，早期研究多是SCS保存结合NMP再灌注评估，没有对NMP平台单独作用机制的研究。2017年，Julia等[18]在灌注液中加入反义寡核苷酸(ASO)，以啮齿动物肾脏为对象，经2 h的NMP，旨在减少肾脏miR-182-5p的表达，从而改善供肾功能，减少损伤。研究结果是乐观的，虽然NMP时间较短，但是该团队利用独立NMP系统作为治疗平台，完成了体外实验，为后续长时间应用NMP平台打下基础。随后，Avinash团队利用不适宜移植的供肾，在灌注液中加入阻滞miR-24-3p的ASO，经6 h的NMP后，血红素加氧酶1(HMOX-1)和1-磷酸鞘氨醇受体1(S1PR1)表达增加。NMP是递送ASO对人类肾脏的基因修饰的高效平台，该研究为后续临床应用提供有力依据[19]。
聚合物纳米颗粒(NP)可封装核酸等成分形成聚合物治疗剂，借助其缓释特性发挥持续的治疗作用[20]。尽管可以通过聚合物表面修饰增强其与靶细胞的结合能力，但是NP进入生物体内后，可以自发地快速吸附其周围的蛋白质，形成"蛋白质冠"。"蛋白质冠"会掩盖靶向配体，影响NP的靶向性，导致NP脱靶，并促使其在血液中迅速被MPS清除[21,22]。尽管目前有研究指出用聚乙二醇对其表面进行改性，可以减少NP表面蛋白质的吸附，增加其在循环中的保留时间，使NP具有"隐身"的特性，但Pelaz团队提出，即便按照理论上最大覆盖率利用聚乙二醇修饰NP，蛋白质可能聚集在NP和聚乙二醇之间，故仍然不能完全避免蛋白质的吸附[23]。主动靶向是提高NP靶向性的另外一种方法。该方法将天然配体或相关抗体与NP缀合以提高亲和力和特异性，可以增加NP与目标细胞接触后停留的可能性，但由于配体-受体的相互作用有距离的限制，全身施用NP后该方法不能控制其准确定位[1,22,24]。NMP提供了将NP直接递送至靶细胞的机会，尤其是IRI和免疫反应损伤的主要靶点血管内皮细胞。最近，Tietjen团队用抗CD31抗体修饰负载染料的聚乳酸聚乙二醇纳米颗粒，证实NMP期间，修饰后的NP定向递送至肾脏血管床的能力显著增强。研究还发现，越是灌注较差的部位，纳米颗粒聚集程度越高[25]。其可能对评价和进一步改善灌注效果有益。该研究也从临床角度验证了NMP提供者外修复平台的可行性与安全性。
目前最常用的NMP的灌注液是基于红细胞的无血浆灌注液，过滤白细胞以减轻炎症和排斥反应。此外，添加甘露醇、地塞米松、葡萄糖、维生素等以扩张血管、降压与提供营养。但是常用灌注液面临着红细胞相对稀缺，溶血以及配型等限制。这些弊端促使携氧载体供氧不足，产生免疫反应，对供肾造成损伤。因此，携氧载体如基于血红蛋白的携氧载体(HBOC)、全合成氧载体(包括全氟化合物和血红素杂交体)等成为当前研究热点。这些携氧载体可为器官提供适量的氧气，纠正ATP损失，降低氧化应激的水平，改善器官的活力。其中尤以HBOC的研究最为活跃。HBOC分为有细胞和无细胞型两种，无细胞型HBOC与红细胞相比存在会与周围组织和血液成分的直接接触或从血管壁泄漏引起毒副作用等弊端。纳米微囊型HBOC属于细胞型HBOC，不仅较好的解决了细胞型HBOC的弊端，而且对其进行表面修饰，具有提高生物相容性和延长血管内作用时间的优势[26,27]。
近些年，NMP的研究领域越来越广泛，除了供肾的保存和质量评估以外，在NMP平台上，结合MSC和NP等治疗方法来改善ECD供肾的IRI，在移植前对供肾进行修复治疗也已成为器官保存的重要研究方向，但仍然存在一些问题，例如NMP技术复杂以及一些治疗方法具体机制与适用条件仍不明确，因此需要更多的基础与临床研究来完善。
所有作者均声明不存在利益冲突
