本研究旨在探讨葛根素对人肾组织性缺氧/复氧(H/R)诱导的急性肾损伤的体外保护作用。
利用肾小管上皮细胞(HK 2)细胞和H/R处理模拟缺血再灌注损伤的体外实验。实验分为对照组(Control)、H/R处理组(0、6、12和24 h)、H/R 24 h +葛根素处理组、H/R 24 h +葛根素+ 3-甲基腺嘌呤(3-MA，Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂)处理组、H/R 24 h + 3-MA处理组。采用免疫印迹法(WB)检测自噬相关蛋白的表达变化，用细胞计数试剂-8(CCK-8)检测细胞增殖情况，电子显微镜检测自噬体形成，原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测凋亡。
与对照组相比，H/R处理组(24 h)微管相关轻链3-II(LC3-II)的表达增加，且自噬标志物P62的表达减少，自噬体数目增多，细胞活力降低，细胞出现炎症反应。葛根素作用与3-MA作用接近，与H/R处理组(24 h)相比，加入葛根素处理后可逆转H/R诱导的LC3、P62表达水平变化(P<0.05)，表现为细胞活力增加，降低了自噬体数目，减轻了细胞凋亡(P<0.05)。同时高迁移率族蛋白1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)和活化B淋巴细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)的蛋白表达水平降低(P<0.05)。
葛根素可以通过HMGB1/TLR4/NF-κB轴抑制自噬来减轻体外模型的缺血再灌注损伤。
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肾移植是终末期肾病的最有效治疗方法，但供肾获取、保存运输及移植的过程中将不可避免的受到缺血再灌注损伤(IRI)[1]。自噬在肾缺血再灌注损伤中起重要作用，但其作用机制尚不明确，在缺血阶段，自噬发挥保护细胞的作用，而在再灌注阶段，自噬可能会进一步加重细胞损伤甚至导致细胞死亡[2]。
葛根素是葛根关键活性成分。此外，也有研究表明葛根素通过自噬调节减轻内质网应激、改善细胞凋亡、提高细胞存活等[3,4]，在心、脑缺血再灌注中的起到保护作[5]，但目前尚无对肾脏缺血再灌注损伤作用的报道。本研究拟通过人肾小管上皮细胞体外构建缺氧/复氧(H/R)模型，探讨葛根素对缺血再灌注(IR)引起的肾损伤的保护机制。
胎牛血清、细胞培养基DMEM/F12、RNA抽提试剂Trizol试剂盒、实时荧光定量PCR(RT-PCR)购于生工生物工程(上海)股份有限公司，谷氨酰胺(4 mmol/L)、细胞培养用青霉素-链霉素、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、白细胞介素(IL)1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α购于碧云天生物技术公司，蛋白和抗体均购于Abcam-艾博抗(上海)贸易有限公司，CCK-8试剂盒购于MedChemExpress公司。
人肾小管上皮细胞(HK-2)，购于武汉普诺赛Procell(CL-0109)。将HK-2细胞置于10 cm培养皿(含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液)，37℃，5% CO2培养箱环境中体外传代培养。
HK-2细胞接种于10 cm培养皿后在培养箱中建立的H/R损伤模型[5]，条件见表1。
HK-2细胞培养缺血再灌注损伤模型条件
HK-2细胞培养缺血再灌注损伤模型条件
| 阶段 | 时间(h) | O2(%) | CO2(%) | N2(%) | DMEM/F12 |
|---|---|---|---|---|---|
| 缺氧 | 6 | 1 | 5 | 94 | 无血清 |
| 复氧 | 6 | 21 | 5 | 74 | 10% FBS |
注：O2为氧气；CO2为二氧化碳；N2为氮气；DMEM/F12为细胞培养基；FBS为胎牛血清
将HK-2细胞在H/R环境中孵育24 h，存在或不存在III类磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(3-MA ，自噬抑制剂)的情况下，用10 mmol/L葛根素处理细胞。葛根素购于Sigma-Aldrich。
将HK-2细胞置于10 cm培养皿，培养方式同前。实验一：(1)对照组(单纯进行细胞培养)；(2)H/R 0 h；(3)H/R 6 h；(4)H/R 12 h；(5)H/R 24 h。实验二：(1)对照组(单纯进行细胞培养)；(2)H/R 24 h+二甲基亚砜(DMSO)；(3)H/R 24 h+葛根素；(4)H/R 24 h+葛根素+ 3-MA；(5)H/R 24 h+3-MA。
使用蛋白质印迹法定量细胞中微管相关轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和泛素结合蛋白(P62)蛋白的水平。一抗LC3、P62、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)、活化B淋巴细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)，稀释比例参考抗体说明书。按照实验设计要求提取细胞中的蛋白质并计算浓度，经过变性等处理，10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，封闭，孵育一抗和二抗，显影，通过β-Actin条带的强度进行校正。
用含有2%戊二醛，1%甲醛和10 mmol/L磷酸钠(pH 7.2)的固定剂对HK-2细胞进行固定。在一系列梯度丙酮中脱水，包埋在环氧树脂中。用超薄切片机切割超薄切片，用加入2%的乙酸铀酰和柠檬酸铅，通过标准程序进行处理，并在电子显微镜下拍照。
检测HK-2细胞中P62、HMGB1、TLR4和NF-κB表达，RNA抽提参照Trizol试剂盒的方法进行。用禽骨髓母细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶进行逆转录合成cDNA。再以此cDNA为模板按荧光定量PCR试剂盒说明进行实施RT-PCR反应。引物序列见表2。目的基因mRNA相对表达量＝2-ΔΔCt，肌动蛋白(β-Actin)作为内对照。
RT-PCR引物信息
RT-PCR引物信息
| 蛋白 | 方向 | 引物序列 |
|---|---|---|
| p62 | 上行 | GCTACACTTCGCCGTCGTG |
| 下行 | CCGAACCACAACCTCAGAA | |
| HMGB1 | 上行 | GCATCCTGGCTTATCCATTGG |
| 下行 | GGCTGCTTGTCATCTGCTGC | |
| TNF-α | 上行 | CAGGCGGTGCCTATGTCTC |
| 下行 | CGATCACCCCGAAGTTCAGT | |
| TLR4 | 上行 | GCCTTTCAGGGAATTAAGCTCC |
| 下行 | GATCAACCGATGGACGTGTAAA | |
| β-actin | 上行 | AACAGTCCGCCTAGAAGCAC |
| 下行 | CGTTGACATCCGTAAAGACC |
注：RT-PCR为实时荧光定量PCR；p62为泛素结合蛋白；HMGB1为高迁移率族蛋白1；TNF-α为肿瘤坏死因子-α；TLR4为Toll样受体4；β-actin为内参蛋白
ELISA法测定肾IR损伤产生的炎症反应标志物白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。使用ELISA试剂盒测细胞裂解后收集的上清中的IL-1β和TNF-α的水平，根据试剂盒说明书步骤进行实验。
根据CCK-8试剂盒使用说明，在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔)，将培养板放在培养箱中预培养24 h，然后向每孔加入10 μl的细胞计数试剂-8(CCK-8)溶液，将培养板置于培养箱内孵育1~4 h；用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
根据TUNEL检测试剂盒说明书进行操作，最后添加防褪色封固剂以防止荧光猝灭。图像是通过Tissue Gnostics AX10分析系统(Vienna，Austria)获取的。
HMGB1 siRNAs(si-HMGB1)购自基因制药(中国)。原代细胞在6孔板中培养，当融合度为80%时，根据实验说明，使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)用siHMGB1转染细胞。
所有数据均使用SPSS 16.0统计软件版本进行统计学处理。计量资料以Mean±SD表示，统计分析使用独立t检验。为了比较组数据，执行了单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
HK-2细胞缺氧6 h，然后在0、6、12和24 h再复氧，免疫印迹法(WB)结果表明，LC3-Ⅱ的表达水平与复氧时间呈正相关性，在24 h表达水平最高，P62的表达则呈现相反趋势(图1A、图1B)。在各时间节点，通过CCK-8分别测定的细胞活力，发现随时间增加细胞活力降低，在24 h处细胞活力最低(图1C)。同时利用ELISA检测细胞培养液中炎症相关细胞因子的表达，结果发现IL-1β和TNF-α表达也随复氧时间的增加而增加，且在24 h累积最为明显。实验结果表明在H/R损伤诱导后HK-2细胞出现炎症反应及自噬产生，且在24 h自噬被过度激活。
注：n.s表示无统计学意义；*为P<0.05，**为P<0.001
为观察葛根素对HK-2细胞在H/R损伤中的影响。我们通过RT-PCR与WB观察自噬相关蛋白LC3和P62，发现与对照组(Control)组相比，在H/R 24 h时自噬程度最大(图2A、图2B)，且细胞活力最差(图2A，图2B，图2C)。通过透射电镜检测各组细胞中自噬体，结果发现应用葛根素干预后，过度自噬现象明显减少，与3-MA作用效果相似，但两者同时干预后自噬标志物P62明显增加，且细胞活力相较单纯葛根素组与3-MA组都有明显增加(图2D)。葛根素的干预同样降低了细胞凋亡程度(图2E)。在葛根素抑制HK-2过度自噬的同时，炎症因子IL-1β和TNF-α也表达降低(图2F和图2G)，但与3-MA联合运用并没有起到双重联合作用。总的来说，葛根素在H/R过程中起到有效抑制过度自噬对HK-2细胞损伤的作用。
注：n.s表示无统计学意义；*为P<0.05，**为P<0.001，***为P<0.000 1
通过免疫印迹法(WB)和RT-PCR检测各组细胞中HMGB1、TLR4和NF-κB的表达，结果发现与对照组(Control)组相比，模型组HMGB1、TLR4和NF-κB表达呈现上升趋势。此外，我们证明敲除HMGB1还下调了TLR4和NF-κB的表达，葛根素干预后可以起到抑制这种效应的作用(图3)，结合上述实验结果提示葛根素可以通过调节HMGB1/TLR4/NF-κB轴调节自噬水平。
注：**为P<0.01 H/R 24 h+DMSO比对照组；&&为P<0.01 H/R24 h+DMSO比H/R 24 h+葛根素；##为P<0.01 H/R24 h+葛根素+Si-NC比H/R24 h+葛根素+Si-HMGB1；@为P<0.01 H/R24 h+葛根素+Si-HMGB1比H/R24 h+ Si-HMGB1
肾脏IRI常常发生于肾移植手术及严重创伤以后，对肾移植术后受者康复及存活率具有重要的影响，但目前其机制和防治策略仍需要进一步明确[6]。肾脏IRI的发生机制主要涉及氧化应激损伤、肾组织炎症和天然免疫反应激活等。其中，肾小管上皮细胞(TEC)损伤是导致肾脏IRI的中心环节。TEC的损伤可表现为早期刷毛边界的丧失和细胞肿胀，并可在后期导致细胞凋亡甚至坏死。近年来，对急性TEC损伤的研究重点主要集中在可控性细胞死亡、自噬变化和细胞周期停滞[7]。本研究结果表明自噬在TEC的H/R中被激活，葛根素可能通过抑制自噬减轻TEC的H/R造成的损伤。
自噬被认为是发生在基线水平以维持通过消化受损的蛋白质并回收营养以维持细胞存活来实现细胞稳态。本研究发现自噬在TEC的H/R损伤中被激活，抑制自噬可能减轻细胞损伤。同时，葛根素可能通过抑制细胞自噬流发挥对TEC的保护作用。既往研究表明，葛根素可能通过调节c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT信号通路抑制自噬并减轻心脑缺血再灌注损伤[8,9]。本研究与上述研究结果一致。
有研究表明，葛根素可以通过抑制聚合苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP-1)阻止HMGB1介导的TLR4-NF-κB信号通路，减轻脂多糖诱导的心肌纤维化[10]；也可降低小鼠血管内皮细胞HMGB1的释放[11]，而抑制HMGB1可以通过调节自噬通量来减少足细胞凋亡和上皮-间充质转化，HMGB1-siRNA和雷帕霉素联合治疗可能通过调节自噬稳态改善足细胞损伤[12]。本研究结果显示葛根素预处理可以通过调节自噬蛋白LC3和p62的表达调节自噬水平，提示葛根素可能通过HMGB1/TLR4/NF-κB轴调节自噬减轻肾脏的IRI。
综上所述，本研究表明自噬在肾脏IRI的病理生理过程中被激活，葛根素可以通过抑制自噬减轻肾脏IRI，这可能是诊断和治疗肾损伤的新目标。但本研究存在一些局限性，还需要更多动物实验来进一步明确其涉及的具体机制。
所有作者均声明不存在利益冲突
