随着边缘供肾使用的增加，缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)相关并发症的发生率显著增高，低温氧合机械灌注(hypothermic oxygenated perfusion，HOPE)可能是一种行之有效的减轻IRI的方法。本文介绍了HOPE中常用的氧合方式、氧气在供肾保存中发挥的作用及其机制，并提出后续肾脏保存方法及HOPE技术的优化需要解决的问题。
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肾移植是治疗终末期肾病的有效方法之一。截至2019年，我国预估有1.2亿慢性肾脏病患者[1]，目前我国肾移植供需矛盾面临严重的挑战，2016年每55例透析患者中，仅有1例能在次年接受肾移植手术(供需比例仅为1：55)[2]。随着边缘供肾使用的增加，移植物功能延迟(delayed graft function，DGF)、原发性无功能(primary non function，PNF)及急性排斥反应(acute rejection，AR)等缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)相关并发症发病率逐渐增加，改良供肾保存技术的重要性与日俱增。目前器官移植临床最常用的器官保存方式有两种：静态冷保存(static cold storage，SCS)和低温机械灌注(hypothermic machine perfusion，HMP)[3]。SCS通过降低细胞代谢率可以避免细胞能量耗竭，从而减少细胞损伤及死亡，避免损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMGs)的释放及后续炎症反应的发生，且因其操作简单获得了广泛的应用。HMP则可维持血管床通畅减少血管相关并发症，另外也可清除代谢废物及炎症因子减低再灌注后的炎症反应[4]。大量证据表明，HMP可以提高短期肾功能，降低DGF、PNF等短期并发症发病率[5]。但研究表明，在4℃时，仍存在10%的细胞代谢率[6]，会导致细胞缺氧，使得再灌注后线粒体呼吸爆发产生大量氧自由基损伤供肾细胞。故而在机械灌注中添加氧气可能是减轻IRI的策略之一。目前已有大量临床研究证实，低温氧合机械灌注(hypothermic oxygenated perfusion，HOPE)在肾移植中可以改善肾功能恢复情况，降低DGF及AR发生。
HOPE目前研究中使用最多的携氧方式包括逆行氧渗透、高压氧渗透和氧载体[7]。逆行氧渗透指将过滤和增湿的氧气直接通过肾血管鼓入，之后气体通过器官表面微穿刺孔排泄，多用于SCS，由于HMP的发展目前已较少使用。高压氧渗透多通过增加气体压力，并使用膜式氧合器增加接触面积的方式以提高氧气的溶解度，大量的临床前期研究已证实其可以改善肾功能恢复情况，降低排斥反应的发生。目前已有使用中空纤维氧合器结合HMP的产品投入使用且在临床研究中证明了其有效性[8]。氧载体主要包括全氟碳化物(perfluorocarbons，PFCs)及血红蛋白载体。PFCs是一种具有很高的溶氧能力的惰性溶液，可以在浓度梯度下释放氧气，从而在组织中释放较高浓度的氧气，目前已有研究表明其在胰腺保存中的有效性[9]。血红蛋白载体主要有人源化血红蛋白囊泡、Hemarina-M101(M101)等。M101是一种来源于海洋无脊椎动物的呼吸色素，对氧有极高的亲和力，在很大的温度范围(4℃~37℃)下工作，可逆梯度释放氧气[10]，在胰腺移植及肾移植的临床前研究中均证实其可发挥积极的作用[11,12]。
IRI的发生主要源于细胞线粒体血流重建后呼吸爆发产生大量氧自由基、细胞膜三磷酸腺苷(ATP)酶功能异常导致的胞膜电位异常和钙超载[13]。在灌注过程中添加氧气可以维持在低温下存在的少量的有氧代谢，维持细胞膜电位的稳定，减少再灌注后产生的氧自由基，从而减轻IRI并保留细胞功能[14]。Patel等[15]使用13C标记葡萄糖研究21%和95%氧气浓度下肾脏代谢情况，研究表明在HMP下，灌注液中补充高浓度氧比空气的有氧代谢程度更高，高浓度氧组肾脏皮质ATP水平亦明显高于补充空气组(19.8 mmol/mg和2.8 mmol/mg，P＝0.029)。Ravaioli等[16]使用了在保存末期进行HOPE的策略，发现在22 h的冷保存后，冷保存下给予高压氧或标准HMP均会加剧ATP的耗竭，而常压或高压氧HOPE均可促进ATP的净增长。Venema等[17]的研究也证实HMP期间100%氧HOPE的标志着线粒体损伤的天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平明显低于HMP期间0%和21%氧HOPE，且添加21%或100%的氧气在灌注期间ATP生成显著升高。一项利用猪肾进行自体移植的研究亦发现，再灌注后常规HMP组自由基导致的脂质过氧化可达到HOPE组的2倍，且移植后前两日HOPE组有更高的肌酐清除率[18]。
有大量的临床前研究证明HOPE可改善短期肾功能。Hoyer等[19]证实HOPE可显著增加再灌注期间的血流量，且其肌酐清除率可达HMP的2倍。再灌注期间结构完整性分析显示，与HOPE相比，HMP组乳酸脱氢酶、γ-谷氨酰转移酶(GGT)含量明显增高。Darius等[20]进行了30%氧HOPE、100%氧HOPE和HMP及SCS的比较，发现供氧组的移植物恢复均较好，且氧合与肾阻力更快、更持久的下降有关。Kasil等[21]的研究中使用M101作为氧载体进行了HOPE，其结果显示M101组保存的肾脏阻力较低，移植后第1周M101组的血肌酐较低，肾小球滤过率较好。移植后3个月M101组肾纤维化程度较轻。由于灌注过程中耗氧量与肾功能的正相关，有研究者提出HOPE中检测耗氧量并将之作为评估供肾的指标。Bunegin等[22]的研究证实HOPE的耗氧量与保存后肾小球滤过率显著相关(R2＝0.871，P<0.05)，灌注中耗氧量越高，保存后肾小球滤过率越好。
在现有研究中，有证据提示早期启动再灌注损伤与随后的免疫系统激活之间存在密切联系[23]。这可能与细胞死亡导致损伤相关分子模式的大量产生，增加固有免疫并提高移植物免疫原性有关[24]。Kron等[25]的研究发现冷保存后HOPE的肾脏在植入后活性氧释放减低，巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞激活明显减少，提示使用HOPE可以明显减弱免疫系统的激活。Kron等[26]使用大鼠进行肾移植比较了同基因(BN大鼠肾脏移植至BN大鼠)组、同种异体(Lewis大鼠肾脏移植至BN大鼠)未处理组、同种异体他克莫司组及同种异体HOPE组的免疫反应情况。研究发现IRI相关标志物TLR-4、Myd88等同种异体HOPE组结果类似于使用他克莫司组，明显低于同种异体未处理组；血肌酐水平亦呈现出类似的情况。另外在该研究中进行了肾脏标本CD3、CD68及天狼星红染色，并对血液中的CD3+T细胞进行了定量，发现与未经任何处理的同种异体肾移植相比，使用HOPE或他克莫司进行免疫抑制具有同等的保护作用，均可使巨噬细胞和树突状细胞激活降低，CD4和CD8染色证实的活化阳性T细胞的数量减少，减轻严重纤维化的早期迹象。移植后10 d按照Banff分级进行的补体C5染色和组织学评分显示免疫抑制治疗可以预防急性排斥反应的发生，且HOPE可实现同等的保护。HOPE在肝脏保存中也呈现出类似的效果[27]。但HOPE具有的抑制免疫反应激活的作用持续的时间及其与小剂量免疫抑制剂联用的效果尚无文献支持。
HOPE因其可更好的保存边缘供肾的特性，目前已有研究针对于扩大标准的供者(extend criteria donor，ECD)的临床研究进行以评估其在肾脏保存及早期肾功能中的优势。肾移植中氧合与标准冷灌注保存(Oxygenated versus standard cold perfusion preservation in kidney transplantation，COMPARE)随机对照双盲研究中选取了106对供者年龄大于或等于50岁的肾脏，将同一供者的一对肾脏随机分配至标准HMP或HOPE组后进行了1年的随访[8]。研究发现12个月时，HOPE组平均eGFR为50.5 ml/(min·1.73 m2)，HMP组为46.7 ml/(min·1.73 m2)[平均差值3.7 ml/(min·1.73 m2)，95%CI 1.0~8.4，P＝0.12]。HOPE组严重并发症(Clavien-DindoⅢb级或以上)低于HMP组。HOPE组移植物失败率低于HMP组(P＝0.028)。另外HOPE组较标准HMP组活检显示的急性排斥反应的相对风险降低44%(P＝0.040)，且HMP组移植后3个月急性排斥反应发生率较高。但在该研究中，并未收集钙调神经磷酸酶抑制剂浓度谷值及供者特异性抗体相关资料。Ravaioli等[28]的研究对比了10例HOPE和30例SCS肾移植的结局，发现HOPE只有20%的人发生DGF，而SCS有40%的人发生了DGF(P＝0.608)，HOPE移植后肌酐水平也呈现出低于SCS的趋势。Meister等[29]的研究主要关注了HOPE在ECD供肾保存中的作用，比较了ECD供肾使用HOPE或SCS在6个月的随访期内的DGF和术后并发症、灌注参数。HOPE组和SCS组的DGF的发生率分别为53%和33%，差异无统计学意义(P＝0.197)，供肾存活率HOPE组明显高于SCS组(P＝0.041)。意大利移植中心因活检评分减少(右肾6分，左肾7分)将1例78岁脑死亡妇女的边缘供肾放弃。Ravaioli等[30]通过HOPE恢复和保存了这2个肾脏，1 h后肾血流增加和乳酸水平降低后进行了双肾移植。移植后即刻移植肾功能良好，术后3个月血肌酐为0.95 mg/dl。提示HOPE具有一定的供肾修复作用。
此外，使用新型氧载体携氧用于肾移植以评估其生物安全性及临床效果的临床研究也在进行之中。Le Meur等[31]的研究中使用M101作为氧载体进行了配对设计，在HMP或SCS中同一供者的一对肾脏随机添加M101或不添加M101进行比较。在移植后前3个月，未发现与M101相关的过敏性反应或感染并发症，且M101组与对照组不良反应构成类似，且其并发症发生率与当前水平类似，证实了其短期的生物安全性。肾功能恢复的角度来看，相比于对照组，M101组的DGF较少，两组之间的差异(23%比33%)在临床上相关，但差异无统计学意义，且M101组在第1个月的透析次数也明显减少(P＝0.008)。此外，M101组肌酐浓度曲线下面积(第0~7天)明显低于对照组(P＝0.042)。但在该研究中，对照组与M101组之间冷缺血时间差异有统计学意义，其DGF发生的差异亦有可能来源于冷缺血时间的不同。但是，有关M101的长期生物安全性及作用仍缺乏高质量临床研究的支持。
虽然HOPE在肾脏保存中的作用获得了极大的肯定，但仍存在大量的质疑和亟待解决的问题。一方面，HOPE与HMP相比作用不够肯定。一项以猪肾进行的研究在常温灌注评估期间发现HMP中21%氧，100%氧在肌酐清除率、脂质过氧化水平等方面差异无统计学意义，只有在AST和ATP水平上，氧气才有显著的益处[17]。Gallinat等[18]的研究中也发现术后肌酐清除率仅在前2 d差异有统计学意义，之后两组并无差别。此外，氧气在灌注过程中发挥作用的机制仍是需要解决的关键问题之一。各研究的横向对比呈现出相较于常温灌注、自体肾移植，HOPE在同种异体肾移植模型中的肌酐清除率往往呈现出更为显著的差异，提示HOPE对肌酐清除率及估算肾小球滤过率(eGFR)的提高可能是通过降低术后免疫反应而实现的[8]。另外，HOPE起到的降低术后免疫反应的机制亦并未完全清楚。
另一方面，氧气供应的策略及卫生经济学亦是需要进一步研究的问题。灌注中添加氧气的适宜的浓度及压力仍存在争议。Venema等[17]的研究观察到21%氧气与100%氧气用于灌注在ATP层面表现出差异，但在肾功能上并无差别。Darius等[20]研究亦发现30%氧气和100%氧气在功能结果上差异没有统计学意义，但存在明显的代谢差异。对于HOPE最主要的担忧之一即是其充氧导致的氧化应激损伤相关的并发症。有研究发现500 mmHg可导致自由基相关组织损伤轻微加重[18]。Patel等[15]的研究中500 mmHg灌注压进行灌注以硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)作为脂质过氧化的标志进行了氧化应激损伤的评估，发现在21%氧气组与100%氧气组差异并没有统计学意义。但在COMPARE临床研究中采用了600 mmHg的氧分压并未产生相关并发症。此外，也有研究表明HOPE可以降低再灌注后的脂质过氧化水平[18]，提示HOPE在氧化应激上可能存在双面的作用：一方面可以导致机械灌注期间氧化应激损伤的加剧，另一方面又可以降低恢复血流之后的氧化应激损伤。如何在提供氧气进行能量代谢支持的同时减轻氧化应激损伤，即氧气供应最适宜的浓度及压力仍需要进一步的研究进行评估。此外，全时间段进行氧气添加或仅在最后时间进行添加仍未能达成共识。考虑到肾脏的长途运输，可能全时间段供氧存在一定的不安全性，故而提出末端供氧(end-stage)的方式。Darius等[32]在研究中进行多种灌注方式的比较，发现在进行20 h SCS后进行2 h HOPE相较于22 h SCS血肌酐水平明显更低，但并不优于22 h连续HMP或HOPE。也有研究比较了SCS后分别进行HMP和HOPE，亦发现HOPE可改善肾功能[25]。但目前HMP后HOPE策略与全时间段HOPE或全时间段HMP的比较研究仍缺如。此外，HOPE是否有必要用于所有供肾或仅仅是用于边缘供肾的选择仍需要进一步论证。
新型氧载体因其可在低温下结合解离氧分子的特性或许会是解决高压供氧存在的问题的一个突破点。目前已有研究初步证实了其有效性及生物安全性[31]，但其长期安全性及效果评价依旧有大量的工作需要进行。如何改良现有的灌注液体系使其具有携氧功能亦具有现实意义。此外，具有HOPE功能的肾脏保存装置目前在国内尚未有商品化的成品。膜式氧合器如何与肾脏低温机械灌注装置结合使用并增加其安全性及稳定性亦是医工合作可以进行的方向之一。
降低IRI及提升器官保存技术一直以来肾移植研究领域的热点问题，现有的研究提示HOPE可能一定程度上改变现有的困局，为边缘供肾的保存及使用提供新的思路，但目前我们对这一方式依旧知之甚少。HOPE在肾移植中发挥的作用及其发挥降低排斥反应的作用的机制依旧需要大量的同种异体肾移植模型进行评估，最适宜的氧浓度及压力也需要进一步研究，为此方法适应的人群进行的卫生经济学分析及使用工科的手段构建具有HOPE功能的器官保存设施也是很具有价值的。
所有作者均声明不存在利益冲突
