排斥反应是影响移植肾长期存活的最主要因素，其本质是错配的供者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)引发受者免疫反应，错配负荷(mismatch load，ML)越高，排斥反应越强。因此，准确评估ML具有重要意义，而HLA分型是分析ML的基础。从大样本统计学角度，目前应用最广泛的血清学分型方法显示，HLA错配数越多，受者长期存活率越低。但它仅能表现HLA在整体蛋白质大分子水平上有差异，无法反应差异的大小，因而不能准确反应供受者之间的具体ML。随着HLA基因编码、氨基酸序列及晶体结构的阐明，多种HLA分子配型技术也随之发展出来，如功能表位(Eplet)错配分析、PIRCHE评分、氨基酸错配评分(amino-acid mismatch score，AMS)、静电荷错配评分(electrostatic mismatch score，EMS)和HLA抗原表位错配计算法(HLA epitope mismatch algorithm，HLA-EMMA)等。本文现就它们与传统的HLA血清学配型的不同，以及各自的优势和不足进行阐述。
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器官移植是器官功能衰竭患者重要甚至唯一的治疗手段。近年来，移植物的短期存活率大大提高，但长期存活率仍不容乐观。以移植肾为例，10年存活率仅约50%，且近20年未见明显改善，而排斥反应是最主要的危险因素[1,2]。免疫抑制剂的快速发展，使细胞性排斥反应对移植物的损害大大降低，但抗体介导排斥反应(antibody-mediated rejection，AMR)却未见减少，有研究甚至发现近60%的移植肾失功与AMR相关损伤有关[3]。排斥反应的本质是供者错配的抗原，主要是人类白细胞抗原(human leucocyte antigan，HLA)引发受者产生免疫反应；错配程度越高，排斥反应越强。为表述方便，本文中供受者HLA错配程度的量化指标命名为"错配负荷"(mismatch load，ML)。
准确评估ML具有重要临床意义。首先可以指导移植前合理选择受者，通过减少ML降低排斥反应风险，减少免疫抑制剂应用，从而使受者获得更好的生活质量及更长的生存时间；其次可以指导移植后个体化免疫抑制治疗。目前针对排斥反应的预防和治疗，各中心大多经验性应用大剂量多种类的免疫抑制剂，感染、肿瘤、心血管疾病等相关并发症使受者的移植物带功能死亡率居高不下[4,5,6]。因此，对个体化、精准免疫抑制治疗的呼声越来越高，而ML正是其重要的参考依据。ML高时应相对提高免疫抑制剂强度；而ML低时则可以减少。
随着人类对HLA分子研究的逐渐深入，特别是HLA基因的解密、氨基酸序列及晶体结构的阐明，催生出了多种用以评估ML的HLA分子配型技术，如功能表位(Eplet)错配分析、PIRCHE评分、氨基酸错配评分(amino-acid mismatch score，AMS)、静电荷错配评分(electrostatic mismatch score，EMS)和HLA抗原表位错配计算法(HLA epitope mismatch algorithm，HLA-EMMA)等[7]。本文现就它们与传统的HLA血清学配型的不同，及各自的优势和不足进行阐述。
HLA具有高度多态性，分型是分析ML的基础。最早，HLA是以血清学方法进行分型。目前中国人体器官分配与共享计算机系统(China Organ Transplant Response System，COTRS)参考的就是供受者HLA-A、B、DR六位点的血清型。作为器官分配的重要依据，其积极作用毋庸置疑[8]。研究显示，1987—2013年在美国首次接受肾移植的189 141例成人受者中，错配点位每增加1个，移植器官失功风险增加13%；六位点全错配，则风险增加64%[9]。充分说明血清型错配数越多ML越大，但血清分型仅能体现单个HLA抗原在整体大分子蛋白质水平上有差异，无法反映出这种差异的大小，仅通过对比血清型的异同并不能准确反映出具体供受者之间的ML。
随着引物聚合酶链反应、序列特异性寡核苷酸探针等DNA检测技术的出现，HLA基因的核苷酸序列被解码，从而精确解析出HLA分子的全部重要氨基酸序列，奠定了HLA分子分型技术的基础[10]。第一代和第二代DNA测序技术可以稳定的检测出不同HLA分子间编码基因的差异[11]。但由于需时较长，其在死亡捐献供者肾移植配型中应用受限，主要用于活体供肾配型及ML的评估以指导术后免疫抑制剂的使用[12]。第三代DNA测序技术检测用时更短、检测结果精度更高，4 h即可实现HLA高分辨率分型，并可精确至第3区域(High resolution-3 field HLA Typing，HR-3F)，具有广阔的临床应用前景[13]。
相较血清学分型，HLA高分辨率分型可反映出不同HLA分子在氨基酸序列水平的差异，有利于评估错配负荷。从氨基酸水平评估错配负荷有2个层面：一是供受者HLA分子之间氨基酸残基错配的数量(存在多少差异)；二是差异的氨基酸刺激受者产生免疫反应的能力(即免疫原性大小)。Eplet错配分析、PIRCHE、EMS、AMS以及HLA-EMMA等工具从不同的层面和角度评估ML，他们既相互区别，又相互联系。
决定抗原抗体结合特异性的，是位于其表面的少量氨基酸。Duquesnoy[14]通过对HLA分子的氨基酸序列、空间结构和抗原抗体反应特点进行分析，发现这些氨基酸组合位于HLA分子表面，能够与抗体特异性结合，大小约3平方埃；序列可能是连续的，也可能不连续但空间邻近，通常含有2~5个氨基酸，并将其命名为Eplet。Eplet使用数字加字母的形式来表示，如82LR，表示其由HLA分子氨基酸序列中的第82个氨基酸亮氨酸(L)和第83个氨基酸精氨酸(R)组成[15]。目前发现的Eplet总数有513个，其中HLA Ⅰ类抗原有224个，HLA Ⅱ类抗原有289个；已经确认有特异性抗体产生的分别有72个和79个[16]。Duquesnoy和Marrari[17]研发了HLAMatchmaker软件，可以罗列出供受者HLA所有的Eplet，并比对两者之间差异，从而以Eplet错配数来评估错配负荷。
应用HLA血清学分型为致敏受者寻找到HLA高度匹配的供者器官困难重重，这一方面是由于他们自身的HLA血清学分型在人群中通常较为稀有，难以实现高度匹配；另一方面，由于不能准确反应HLA分子间的真实差异，应用HLA血清学分型为高致敏受者匹配供者并不可靠。例如：血清学分型HLA-A24，其HR-2F分型可能为含有Eplet166DG的HLA-A*24∶02，也可能为不含有的HLA-A*24∶03；如果受者的HLA分型为HLA-A*24∶03，其体内可能预存针对Eplet166DG的抗体，一旦将HLA-A*24∶02的供体器官移植入受者体内，那么就有可能发生严重的排斥反应从而导致移植失败[18]。
使用Eplet错配分析还会增加寻找到合适供者的概率[19]。欧洲国家器官储运组织将Eplet错配分析用于为高致敏受者制订可接受错配(acceptable mismatch，AM)方案[20,21]。AM方案通过寻找不与受者体内的抗体发生反应的非己HLA抗原，作为可接受的错配与自身的HLA一同纳入匹配系统中，从而提高受者匹配成功以及移植成功的概率，但HLA的极度多态性使得这个过程并不容易[22]。Eplet错配分析则通过模拟计算、虚拟配型大大简化了寻找AM的过程[23]。AM方案至今已经实施了接近30年，不但明显缩短了高致敏受者的等待时间，且大大改善了他们的移植预后，其术后排斥反应发生率及十年移植物存活率都与通过传统方案移植的无致敏受者相当[24,25]。
供受者间HLA Ⅱ类抗原Eplet错配数不但与受者新生供者特异性抗体(de novo donor specific anti-HLA antibodies，dnDSA)明显相关，对AMR的发生也有一定的预测价值[26]。Tafulo等[27]对151对活体肾移植的供受者进行研究后发现，HLA Ⅱ Eplet错配数大于13个的受者与错配数小于5个的受者相比，AMR发生率明显升高。单个HLA位点间的Eplet错配同样有重要意义，有研究发现HLA-DQ位确定产生抗体的Eplet错配数(antibody-verified eplet mismatch，AbVer MM)与HLA-DQ DSA发生率呈线性相关[28]。在心、肺、肝等其他实体器官移植中，供受者间的Eplet错配数与受者预后也有明显相关性[29,30,31]。
免疫抑制剂的使用与受者的免疫反应风险息息相关，用Eplet错配分析来评估ML，可为临床医生制定决策提供参考。法国的一项研究发现，在由环孢素更换为依维莫司的肾移植受者中，Eplet错配数与dnDSA的出现明显相关，错配数大于27个的受试者产生dnDSA的相对风险是错配数低于27个受试者的12倍[32]。Wiebe等[33]在对596例肾移植受者的研究中发现术后他克莫司浓度<5 ng/ml以及供受者间HLA DR/DQ Eplet错配数>11个，同为dnDSA的独立危险因素。
供者与受者间的不同的Eplet是膜表面免疫球蛋白--B细胞受体(B cell antigen receptors，BCR)与非己的HLA分子结合的关键。BCR结合特异性抗原启动B细胞活化，进而启动体液免疫反应。因此，Eplet差异数与体液免疫关系密切。Eplet错配分析是第一个也是发展时间最长的HLA分子配型技术，使组织配型进入氨基酸分子水平，与血清学分型相比，有明显的临床应用优势[34]。
目前，如何评估不同Eplet免疫原性的差异是其临床应用的难题。研究显示，不同Eplet与BCR结合引起免疫反应的能力(免疫原性)不同，与抗体的结合能力(抗原性)也不同[35]。部分Eplet与BCR结合后抗体产生的频率较高，有的则较低或者只在受者依从性差、免疫抑制强度低时发生，甚至不引起抗体产生[36,37]。如果仅单纯计算供受者间Eplet错配的数量而不加甄别，就会出现与预后不相符的现象[38]。美国的研究人员对118 382例初次接发肾移植手术受者的Eplet错配情况进行了调查，并将错配的Eplet分为AbVer MM和尚未发现抗体的Eplet(non AbVer)，结果发现AbVer MM与受者的存活率相关性很强，而non AbVer MM与存活率无关[39,40]。Senev等[28]对926对肾移植供受者进行研究后发现，AbVer MM是移植物失功及dnDSA产生的独立危险因素。同时需要注意的是，某些Eplet可能具有极高的免疫原性。一项包含240例心脏移植受者的研究显示，Eplet错配数与术后新生DSA没有相关性，但高频出现特异性抗体的Eplet与DSA却有明显相关，随后研究者在针对肺移植受者的研究中验证了这个结论[41]。
影响Eplet免疫原性和抗原性的因素有：(1)Eplet氨基酸残基的理化性质[42]。抗原与抗体或BCR结合主要依靠两者反应界面形成的氢键、盐键、疏水键和范德华力等，这些作用则主要受区域内氨基酸理化性质的影响[43]。以Eplet的理化性质为基础进行的Ellipro分数的计算就是考虑到这一点[44]。(2)同一个HLA大分子中不同Eplet间的相互作用[45]。Duquesnoy[46]发现位于非己Eplet 15埃范围内的同己Eplet可以稳定抗体的结合。此外，在血管内皮细胞表面高表达的HLA分子引起免疫反应的可能性更大[47,48,49]。影响HLA分子表达的因素众多，如移植手术、感染、自身免疫性疾病等，如HLA DQ在移植心脏的血管内皮细胞表面的表达水平在移植前后有巨大差异，而HLA DP的表达则可受乙肝病毒感染的影响[50,51]。
(1)尚无法直接进行Eplet检测。目前对致敏受者体内的HLA抗体进行Eplet特异性分析时，仍然是基于HLA分子与受者血清的交叉反应来推测，但受血清收集处理、检测试剂盒的容量限制，不同机构及试剂公司对于检测结果的判读差异等，使得难以对Eplet进行确定的判断[52,53,54]。
(2)Eplet数据库仍有待完善。目前Eplet的研究对象以白种人为主，考虑到HLA的高度多态性和种族差异性，这些研究成果能否应用于其他种族仍需要进一步的本土化研究来验证[55]。
(3)以Eplet的抗原性推测其免疫原性。Eplet错配分析以抗原抗体反应为基础，以Eplet抗原性大小推测其可能激发的免疫反应强度，但人体免疫反应过程包括抗原提呈、T细胞活化、T-B细胞交互刺激等多个步骤，仅以Eplet错配分析来推测激发免疫反应的强度具有明显局限性[56]。研究显示，如含有较多错配HLA Ⅱ类分子，则受者更易在移植术后发生DSA；供者的HLA被受者的抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)分解后，不但位于表面的氨基酸，位于内部的氨基酸同样可被提呈从而影响免疫反应强度[57,58,59,60]。
Eplet错配分析围绕HLA分子的B细胞抗原表位，B细胞产生高亲和力抗体离不开T细胞活化后的辅助，而HLA的T细胞抗原表位与B细胞表位并非一致[61]。早在20世纪90年代，研究者们已经发现在移植术后的免疫反应中，不但供者的HLA会对其产生影响，受者的HLA也同样会产生影响[59]。原因是不同的受者HLA分子对相同的非己HLA抗原的提呈能力不同。供者HLA分子被受者主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)捕获后分解为肽段，再装配到受者HLA分子上提呈给T细胞，从而使T细胞活化[62,63]。但并非所有的肽段都会被MHC提呈，而是根据MHC结合域的空间构象和电荷属性有所选择。Geneugelijk和Spierings[64]利用PIRCHE计算工具对这一抗原提呈过程进行模拟，评估供者HLA分子分解为肽段后被受者HLA提呈给T细胞的可能性，并最终计算出的可被提呈的肽段数量即为PIRCHE评分。提呈抗原的MHC Ⅰ类途径和MHC Ⅱ类途径，分别对应PIRCHE Ⅰ评分和PIRCHE Ⅱ评分。
PIRCHE评分是对供者HLA分子引发受者T细胞反应能力的评估，从T细胞免疫的角度，推测供者HLA被受者HLA装配提呈的可能性，理论上能较好反应供受者间错配HLA的T细胞免疫原性，从而可以从另一个角度评估ML。在实体器官移植中，供者的HLA分子作为外源性抗原主要经MHC Ⅱ类途径提呈，所以与PIRCHE Ⅱ评分关系最为密切。
目前，有关PIRCHE评分的临床研究非常活跃。Lachmann等[65]对2 787例肾移植受者的研究发现，PIRCHE Ⅱ评分越高，受者术后新生DSA的发生率越高，PIRCHE Ⅱ评分是受者术后新生DSA的独立危险因素。在肝移植、胰腺移植和胰岛移植受者的研究中，也有类似发现[66,67]。国内郑瑾等[68]对798例肾移植供受者HLA抗原基因及抗体频率的分析发现，PIRCHE评分越高，术后产生DSA和发生AMR的概率越高。Geneugelijk等[69]一项2 918例肾移植受者的研究发现，PIRCHE Ⅱ评分不但与移植肾的长期存活明显相关，与小于6个月的短期存活也明显相关，且调整后的PIRCHE Ⅱ评分的自然对数，与更高的移植物失功率显著相关。
首先，在间接提呈过程中，供者的HLA分子会被受者APC完整的内化裂解，因此已知的完整HLA分子氨基酸序列是研究的前提，但目前的IMGT/HLA数据库中，有完整氨基酸序列的HLA分子还不足十分之一，这严重影响了PIRCHE评分的准确度[70]。
其次，PIRCHE Ⅱ尚没有非常精确的计算方法[71]。MHC Ⅰ类途径，由于抗原降解反应场所相对固定，且MHC Ⅰ类分子结合多肽的部位结构相对封闭，所以PIRCHE Ⅰ的计算较为准确[72]。MHC Ⅱ类途径则由于外来抗原水解酶及水解反应场所都不固定，且MHC Ⅱ类分子与多肽结合部位的结构两端开放，可结合多肽的氨基酸序列差异很大，所以PIRCHE Ⅱ尚没有很好的计算工具，目前以相对准确的NetMHCIIpan来进行计算[73]。
第三，目前尚没有涉及对单个PIRCHE的研究。因此，PIRCHE评分要应用于临床，仍有很长的路要走。
Kosmoliaptsis等[74]在HLA分子氨基酸序列和晶体结构的研究基础上，计算供受者间位于同一位点或构型相似的不同位点间，处于HLA分子表面且能够与抗体接触的不同的氨基酸数量，并将其称为氨基酸错配评分(amino-acid mismatch score，AMS)或氨基酸序列比对(Amino Acid Sequence Comparison)。HLA-EMMA则进一步通过NetSurfP 2.0和Porter Pale 4.0等蛋白质深度学习工具分析这些错配氨基酸的溶剂可及性，从而更加精准的将具有免疫原性的氨基酸纳入错配计算[75,76,77]。静电荷错配评分(electrostatic mismatch score，EMS)则是通过进一步比对错配的氨基酸残基不同的理化性质尤其是静电荷的差异并赋值计算总静电荷差异[74]。2016年Kosmoliaptsis等[74]进行的一项研究提示，供受者间的AMS、EMS以及Eplet错配数与受者术后新生的抗HLA DR和DQ的DSA都明显相关，且三者的差别不大，但只有EMS与抗HLA A和B的新生DSA有关。Bedford等[78]则对73例心肺移植受者分别进行了Eplet错配数、PIRCHE Ⅱ及HLA-EMMA计算，结果发现只有HLA-EMMA计算出的错配总数与受者的dnDSA明显相关。由此可见，氨基酸免疫原性对ML的巨大影响。
EMS包含了供受者间HLA分子氨基酸序列的差异，并将氨基酸的理化性质考虑在内，进一步将HLA的研究推进到了氨基酸侧链甚至原子水平。目前EMS的最新版本是EMS-3D，通过建立HLA分子的晶体模型，定位分布于分子表面的氨基酸残基，计算静电荷分布，通过对比供受者HLA分子间的静电荷差异来评估ML[79]。EMS具有较大的潜在临床应用价值，但目前相关临床研究还不多。
HLA高分辨分型向我们展示了HLA分子的氨基酸序列。以HLA分子的氨基酸序列为基础研发的Eplet错配数、PIRCHE评分、AMS、EMS及HLA-EMMA等，分别从不同角度来评估供受者间的ML，相对于血清型错配数，无论从理论基础上还是在临床实践结果来看，都更为精准。首先，AMS、HLA-EMMA将供受者差异以HLA错配氨基酸的绝对数来表达，相较于血清学错配数，从HLA整个蛋白质分子的水平来比较，提高了信息量。在数量差异的基础上，EMS考虑了氨基酸之间携带静电荷的差异，意图从分析静电荷的差异数来推测ML。Eplet和PIRCHE评分则更进一步，分别依靠导致B细胞活化和T细胞活化的关键结构：B细胞抗原表位和T细胞抗原表位来评估ML。这五种分析方法的特点和侧重详见表1。
不同HLA分子配型方法对比分析
不同HLA分子配型方法对比分析
| 名称 | 原理 | 优点 | 不足 |
|---|---|---|---|
| Eplet错配分析 | 从抗原抗体结合反应出发，分析B细胞抗原决定簇的差异 | 发展时间较长，数据库及计算工具等发展较为成熟；部分Eplet已发现现实存在的特异性抗体；有较多临床研究显示其与DSA产生相关 | 对单个Eplet的抗原性及免疫原性差异评估不足；直接检测技术尚待研发；以抗原性推测免疫原性 |
| PIRCHE评分 | 从抗原的分解提呈并被T细胞识别的过程出发，分析T细胞抗原决定簇的差异 | 既可评估AMR风险，又可评估TCMR风险 | 数据库及计算工具尚不成熟(特别是PIRCHE Ⅱ)；较少临床应用报道；单个PIRCHE差异评估不足 |
| EMS | 分析供受者HLA分子表面氨基酸携带的电荷差异 | ||
| AMS | 分析供受者HLA氨基酸序列中处于同一位置的不同氨基酸的数量 | 从不同角度反应HLA差异氨基酸的免疫原性；进一步将HLA配型推进至单个氨基酸水平；与Eplet相关性较好 | 计算工具尚不成熟；尚无成熟的临床应用报道 |
| HLA-EMMA | 分析供受者HLA不同的氨基酸的溶剂可及性差异 |
注：HLA为人类白细胞抗原；Eplet为功能表位；DSA为特异性抗体；AMR为抗体介导排斥反应；TCMR为T细胞介导排斥反应；EMS为静电荷错配评分；AMS为氨基酸错配评分；HLA-EMMA为HLA抗原表位错配计算法
在体液免疫中，B细胞活化的第一信号依赖外源性抗原与BCR的特异性结合，Eplet错配分析反映了供者HLA分子与BCR的识别，理论上Eplet错配数与B细胞活化第一信号的强弱有关。PIRCHE Ⅱ评分则是基于供者HLA抗原与受者BCR结合并内吞，分解为多肽，与受者HLA Ⅱ类分子结合表达于B细胞表面，刺激Th细胞TCR，Th活化后辅助B细胞进一步活化、增殖并分泌抗体的过程，因此反映刺激B细胞活化的T细胞辅助信号强度的大小。Eplet错配分析与PIRCHE评分是相互独立的HLA免疫原性分析方法，PIRCHE评分所涉及的氨基酸(T细胞抗原表位)，与Eplet错配分析所涉及的氨基酸(B细胞抗原表位)并不完全相同，有62%可以被受者的MHC Ⅱ类分子间接递呈的氨基酸多肽，没有被归于Eplet中[80]。
但是，虽然Eplet错配分析与PIRCHE评分依据的是不同的免疫反应过程，二者也存在联系。供受者间HLA抗原的Eplet错配数越多，被BCR识别结合的可能性就越大，被内吞分解为多肽再装配到MHC Ⅱ分子上，提呈给TCR的可能性也就越大，而这正是PIRCHE Ⅱ的计算范畴。因此，两者对于HLA免疫原性的影响具有协同效应。Meneghini等[81]对169例肾移植受者的研究表明，Eplet错配分析、AMS、PIRCHE Ⅱ都与术后dnDSA相关，但只有PIRCHE Ⅱ与术后新生的供者特异性T细胞(dnDoner Specific T cell，dnDST)的产生相关，dnDST的产生则强烈提示dnDSA的形成。
同时不容忽视的，还有各个Eplet和PIRCHE间的免疫原性差异，这是由它们含有的非己氨基酸数量和理化性质静电荷等因素所决定的[82]。这是ML评价体系的必要部分，而AMS和EMS恰好可以针对这一点给出准确分析。由此可见，不同HLA分子配型方法可以实现互相补充，将他们联合应用到ML评估中的理论基础已经具备，但具体方法还有待实践探索。需要关注的是，目前HLA分子配型技术发展迅速，所应用的数据库及算法持续更新，软件版本不断迭代，在临床应用及学术研究时应予以注意[7]。
随着生命科学的发展，人们的目光越来越聚焦于生命的基本物质基础——核苷酸和氨基酸序列。排斥反应是器官移植领域最大的难题，而免疫抑制治疗所带来的药物毒性、感染、肿瘤等并发症，也使个体化、精准化用药的需求越来越强烈。在此背景下，应用计算机辅助HLA分子配型技术精确评估供受者ML，从而指导临床制定精准治疗方案，获得更好的预后，正是广大基础和临床工作者的目标。目前，研究者们已经分别描绘了HLA免疫原性这个复杂拼图的一部分，如何将其完善并有机结合，将是移植免疫未来研究的重要方向。
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