探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响。
分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷贝/μl的5个浓度检测液各5份，在冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后进行实时荧光定量PCR检测，比较其Ct值。
①浓度1×108、1×107、1×106、1×105、1×104拷贝/μl时，冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后，质粒标准品在ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂中，实时荧光定量PCR检测Ct值中位数分别为17.46和17.32（P>0.05)，23.52和23.61（P>0.05)，26.77和26.37（P>0.05)，32.73和30.88（P<0.05)，33.08和31.51（P<0.05)。②冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次，在ddH2O和TE缓冲液中，各浓度标准品Ct值中位数分别如下：1×108拷贝/μl：17.43、17.56、17.45、17.45、17.26、17.94（P>0.05）和17.38、17.36、17.47、17.31、17.30、17.62（P>0.05)；1×107拷贝/μl：22.17、23.16、24.12、23.51、23.94、23.89（P<0.05）和22.40、24.09、24.07、23.54、23.68、24.05（P<0.05)；1×106拷贝/μl：24.66、25.27、26.66、27.29、27.78、27.40（P<0.05）和24.92、26.22、26.31、26.59、26.93、26.53（P<0.05)；1×105拷贝/μl ：29.25、30.66、32.72、32.84、33.27、33.39（P<0.05）和29.21、30.10、30.97、30.87、31.72、32.44（P<0.05)；1×104拷贝/μl：31.05、30.50、32.99、33.21、33.59、33.41（P<0.05）和31.22、31.28、31.49、31.52、32.37、32.31（P<0.05)。
相对于ddH2O，质粒标准品选择用TE缓冲液作为稀释剂更稳定。质粒标准品随着冻融次数增多，其稳定性越差，因此要避免反复冻融质粒标准品。
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实时荧光定量PCR技术是1996年美国APPlied Biosystems公司推出的一项新兴的定量检测技术，此基因检测技术与传统PCR相比具有定量准确、操作简便快速、灵敏度高、无需PCR后处理等优点，目前已在临床检验定量检测核酸领域中得到广泛应用[1,2,3,4,5]。临床检验人员在工作过程中需要对来自厂家的质粒标准品进行反复冻融和稀释，定量结果的准确性在很大程度上依赖于标准品的准确性。目前实时荧光定量PCR标准品大多为重组质粒[6,7,8,9,10]，为裸露的螺旋缠绕的双链闭环DNA，质粒DNA在低温条件下可长期稳定保存，能与目的基因保持较高的同源性，是得到较为可靠的定量结果的保证。但在冻融过程中由于液固状态体积的改变，会对质粒的结构产生力学作用，破坏质粒DNA物理结构，双链容易被拉断，DNA序列不再完整，参与PCR反应时扩增效率降低，进而影响定量结果。常用的稀释剂有ddH2O和TE缓冲液两种，ddH2O中杂质含量少，可防止DNA的降解，而TE缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗PH改变的溶液，可稳定储存DNA。为全面深入了解冻融次数和稀释剂这两种因素对质粒标准品实时荧光定量PCR检测的影响，我们对不同浓度下不同冻融次数的质粒标准品和不同稀释剂中的质粒标准品进行全面检测，现将结果报道如下。
